304 altzairu herdoilgaitzezko soldadura haritutako tutu / hodi zomponte zhemikoa, Itsas Mikrobiomaren Potentzial Biosintetikoa

Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.CSS laguntza mugatua duen arakatzailearen bertsioa erabiltzen ari zara.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Horrez gain, etengabeko laguntza bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe erakusten dugu.
Diapositiba bakoitzeko hiru artikulu erakusten dituzten graduatzaileak.Erabili atzeko eta hurrengo botoiak diapositibetan zehar mugitzeko, edo amaierako diapositiba kontroladorearen botoiak diapositiba bakoitzean mugitzeko.

Produktu deskribapen zehatza

304 Altzairu herdoilgaitza soldatutako hodi/hodi harildua
1. Zehaztapena: altzairu herdoilgaitzezko bobina hodi / hodi
2. Mota: soldatuta edo josturarik gabe
3. Araua: ASTM A269, ASTM A249
4. Altzairu herdoilgaitzezko bobina hodi OD: 6mm-tik 25,4mm-ra
5. Luzera: 600-3500MM edo bezeroaren eskakizunaren arabera.
6. Hormaren lodiera: 0,2 mm-tik 2,0 mm-ra.

7. Tolerantzia: OD: +/-0.01mm;Lodiera: % +/-0,01.

8. Bobina barruko zuloaren tamaina: 500MM-1500MM (bezeroen eskakizunen arabera egokitu daiteke)

9. Bobinaren altuera: 200MM-400MM (bezeroaren eskakizunen arabera egokitu daiteke)

10. Azalera: distiratsua edo errekozitua
11. Materiala: 304, 304L, 316L, 321, 301, 201, 202, 409, 430, 410, aleazio 625, 825, 2205, 2507, etab.
12. Enbalatzea: ehundutako poltsak zurezko kutxan, egurrezko paletan, egurrezko ardatzean edo bezeroaren eskakizunen arabera
13. Proba: osagai kimikoa, eten-indarra, trakzio-erresistentzia, gogortasunaren neurketa
14. Bermea: hirugarrenen ikuskapena (adibidez: SGS TV ) etab.
15. Aplikazioa: Dekorazioa, altzariak, olio-garraioa, bero-trukagailua, barandak egitea, papera egitea, automobila, elikagaien prozesatzea, medikuntza, etab.

Mikrobio-komunitate naturalak filogenetikoki eta metabolikoki anitzak dira.Aztertutako organismo-taldeez gain1, aniztasun horrek potentzial oparoa du ekologikoki eta bioteknologikoki esanguratsuak diren entzima eta konposatu biokimikoak aurkitzeko2,3.Hala ere, aniztasun hori konposatu horiek sintetizatzen dituzten eta dagozkien ostalariekin lotzen dituzten bide genomikoak zehazteko erronka bat izaten jarraitzen du.Ozeano zabaleko mikroorganismoen potentzial biosintetikoa ezezaguna izaten jarraitzen du, eskala globalean genoma osoaren bereizmenaren datuen analisiaren mugak direla eta.Hemen, ozeanoko gene biosintetikoen klusterren aniztasuna eta aniztasuna aztertzen ditugu, hazkuntzako zelulen eta zelula bakarreko 10.000 mikrobio genoma inguru integratuz, itsas-uraren 1.000 lagin baino gehiagoko 25.000 zirriborro-genoma berriekin.Ahalegin horiek 40.000 gene biosintetiko-multzo ustezko gehienak identifikatu dituzte, horietako batzuk orain arte susmatu gabeko talde filogenetikoetan aurkitu direnak.Populazio horietan, landu gabeko bakterio-filo bateko gene-multzo biosintetikoetan aberastutako leinu bat identifikatu genuen («Candidatus Eudormicrobiaceae»), eta ingurune horretako biosintetikoki aniztasun handieneko mikroorganismo batzuk biltzen zituena.Horietatik, fosfatasa-peptidoa eta pitonamida bideak ezaugarritu ditugu, eta, hurrenez hurren, ezohiko konposatu bioaktiboen egitura eta entzimologiaren kasuak identifikatu ditugu.Ondorioz, ikerketa honek frogatzen du nola mikrobioman oinarritutako estrategiek aldez aurretik deskribatu gabeko entzimak eta elikagai naturalak esploratzea gaizki ulertzen den mikrobiota eta ingurune batean.
Mikrobioek ziklo biogeokimikoak gidatzen dituzte, elika-sareak mantentzen dituzte eta landareak eta animaliak osasuntsu mantentzen dituzte5.Haien dibertsitate filogenetiko, metaboliko eta funtzional izugarriak taxo1, entzima eta konposatu biokimiko berriak, produktu naturalak barne6, aurkitzeko potentzial aberatsa adierazten du.Komunitate ekologikoetan, molekula hauek hainbat funtzio fisiologiko eta ekologiko eskaintzen dizkiete mikroorganismoei, komunikaziotik hasi eta lehiaraino 2, 7 .Jatorrizko funtzioez gain, produktu natural hauek eta genetikoki kodetutako produkzio-bideek aplikazio bioteknologiko eta terapeutikorako adibideak ematen dituzte2,3.Horrelako bide eta konexioen identifikazioa asko erraztu da hazten diren mikrobioen azterketak.Hala ere, ingurune naturalen azterketa taxonomikoek frogatu dute mikroorganismo gehien-gehienak ez direla landu8.Alborapen kultural honek mikrobio askok kodetutako aniztasun funtzionala ustiatzeko dugun gaitasuna mugatzen du4,9.
Muga horiek gainditzeko, azken hamarkadako aurrerapen teknologikoek komunitate osoetako (metagenomika) edo zelula bakarreko mikrobioen DNA zatiak zuzenean (hau da, aldez aurretiko kulturarik gabe) sekuentziatu ahal izan dituzte.Zati hauek genoma zati handiagoetan biltzeko eta metagenomikoki bildutako genoma (MAG) edo anplifikatu bakarreko genoma (SAG) berreraikitzeko gaitasunak aukera garrantzitsua ematen du mikrobiomaren (hau da, mikrobio-komunitateak eta mikrobioma) azterketa taxozentrikoetarako.bide berriak zabaldu.berezko material genetikoa ingurune jakin batean) 10,11,12.Izan ere, azken ikerketek asko hedatu dute Lurrean mikrobioen aniztasunaren irudikapen filogenetikoa1, 13 eta lehen hazitako mikroorganismoen erreferentzia genoma sekuentziak (REF) estalita ez zuten mikroorganismo indibidualetako aniztasun funtzionalaren zati handi bat agerian utzi dute14.Deskubritu gabeko aniztasun funtzionala ostalariaren genomaren testuinguruan kokatzeko gaitasuna (hau da, genomaren bereizmena) funtsezkoa da produktu natural berriak kodetzen dituzten oraindik ezaugarritu gabeko mikrobio-lerroak aurreikusteko15,16 edo konposatu horiek jatorrizko ekoizleraino itzultzeko17.Esaterako, analisi metagenomiko eta zelula bakarreko genomikoaren ikuspegi konbinatuak Candidatus Entotheonella, metabolikoki aberatsa den belakiarekin lotutako bakterioen talde bat, hainbat droga-potentzialen ekoizle gisa identifikatzea ekarri du18.Hala ere, mikrobio-komunitate askotarikoen esplorazio genomikoaren azken saiakerak egin arren,16,19 Lurreko ekosistemen ozeano handienaren datu metagenomiko globalen bi heren baino gehiago oraindik falta dira.Beraz, orokorrean, itsas mikrobiomaren biosintetiko potentziala eta produktu entzimatiko eta natural berrien biltegi gisa duen potentziala oso gutxi aztertzen jarraitzen dute.
Itsas mikrobiomen biosintetikoa eskala globalean arakatzeko, lehenik eta behin, kulturaren menpeko eta kulturaz kanpoko metodoak erabiliz lortutako itsas mikrobioen genomak batu genituen filogenetikaren eta geneen funtzioaren datu-base zabal bat sortzeko.Datu-base hau aztertuta, askotariko gene-multzo biosintetikoak (BGC) agerian utzi zituen, gehienak oraindik ezaugarritu gabeko gene-kluster (GCF) familietakoak.Horrez gain, orain arte ozeano zabaleko BGC-en aniztasunik handiena erakusten duen bakterio-familia ezezagun bat identifikatu dugu.Bi erribosomaren sintesi eta post-translationally modified peptide (RiPP) bide aukeratu genituen baliozkotze esperimentalerako, gaur egun ezagutzen diren bideetatik dituzten desberdintasun genetikoetan oinarrituta.Bide hauen karakterizazio funtzionalak entzimologiaren ustekabeko adibideak eta proteasaren jarduera inhibitzailea duten egituraz ezohiko konposatuak agerian utzi ditu.
Hasieran, genomaren analisirako datu-baliabide global bat sortzea genuen helburu, bere osagai bakterio eta arkeoetan zentratuz.Horretarako, datu metagenomikoak eta mundu osoan banatutako 215 laginketa gunetako (latitude-tartea = 141,6°) eta hainbat geruza sakon (1etik 5600 m arteko sakonera arteko itsas-uraren 1038 lagin batu ditugu, zona pelagikoak, mesopelagikoak eta abisalak estaltzen dituztenak).Aurrekariak21,22,23 (1a irudia, datu hedatuak, 1a irudia eta 1. taula osagarria).Estaldura geografiko zabala eskaintzeaz gain, selektiboki iragazitako lagin hauek itsas mikrobiomaren hainbat osagai alderatu ahal izan zituzten, besteak beste, birusetan aberatsak (<0,2 µm), prokariotoetan aberatsak (0,2-3 µm), partikula aberatsak (0,8 µm). ).–20 µm) eta birusak agortuta (>0,2 µm) koloniak.
a, Mundu osoan banatutako 215 kokapenetatik (62°S-79°N eta 179°W-tik 179°E-ra).Maparen fitxak © Esri.Iturriak: GEBCO, NOAA, CHS, OSU, UNH, CSUMB, National Geographic, DeLorme, NAVTEQ eta Esri.b, metagenoma hauek MAG (metodoak eta informazio osagarria) berreraikitzeko erabili ziren, datu multzoetan (kolorez markatuta) kopuruan eta kalitatean (metodoak) desberdinak direnak.Berreraikitako MAGak publikoki eskuragarri dauden (kanpoko) genomekin osatu ziren, eskuz egindako MAG26, SAG27 eta REF barne.27 Konpilatu OMD.c, SAG (GORG)20 edo MAG (GEM)16 bakarrik oinarritutako aurreko txostenekin alderatuta, OMD-k itsas mikrobio-komunitateen karakterizazio genomikoa hobetzen du (irakurketa metagenomikoaren mapa-tasa; metodoa) bizpahiru aldiz, sakoneko irudikapen koherenteagoarekin eta latitudea..<0.2, n=151, 0.2-0.8, n=67, 0.2-3, n=180, 0.8-20, n=30, >0.2, n=610, <30°, n = 132, 30-60° , n = 73, >60°, n = 42, EPI, n = 174, MES, n = 45, BAT, n = 28. d, OMD espezie multzoen mailan taldekatzeak (% 95eko batez besteko nukleotidoen identitatea) identifikatzen du guztira. gutxi gorabehera 8300 espezie, horietatik erdia baino gehiago GTDB erabiliz ohartarazpen taxonomikoen arabera (89. bertsioa) erabiliz karakterizatu gabe. E, espezieen genoma motaren araberako sailkapenak MAG, SAG eta REF-ak elkarren ondoan osatzen direla erakutsi zuen aniztasun filogenetikoa islatzeko. itsas mikrobioma.Bereziki, espezieen %55, %26 eta %11 MAG, SAG eta REF espezifikoak ziren, hurrenez hurren.BATS, Bermuda Atlantic Time Series;GEM, Lurraren mikrobiomaren genomak;GORG, ozeanoaren erreferentziako genoma globala;HOT, Oiasso ozeanoko denbora seriea.
Datu multzo hau erabiliz, guztira 26.293 MAG berreraiki genituen, batez ere bakterioak eta arkeoak (1b. irudia eta datu hedatuak, 1b. irudia).Lagin metagenomiko bateratu baino bereizietatik abiatuta sortu ditugu MAG hauek, kokapen edo denbora-puntu desberdinetako laginen arteko sekuentzia naturalaren aldakuntza kolapsoa saihesteko.Horrez gain, zati genomikoak euren prebalentzia-korrelazioen arabera taldekatu ditugu lagin kopuru handi batean (58tik 610 lagin artean, inkestaren arabera; metodoa).Eskala handiko hainbat MAG16, 19, 25 berreraikitze-lanetan saltatu zen urratsa denbora asko baina garrantzitsua24 dela ikusi genuen eta nabarmen hobetzen duela kantitatea (2,7 aldiz batez beste) eta kalitatea (% 20 batez beste) genoma.Hemen aztertutako itsas metagenomatik berreraikia (datu hedatuak, 2a. irudia eta informazio osagarria).Orokorrean, ahalegin hauek itsas mikrobioen MAG-ak 4,5 bider handitu zituzten (6 aldiz kalitate handiko MAG-ak soilik kontuan hartzen badira) gaur egun dagoen MAG baliabiderik zabalenarekin alderatuta16 (Metodoak).Sortu berri den MAG multzo hau eskuz hautatutako 830 MAG26, 5969 SAG27 eta 1707 REFrekin konbinatu zen.Itsas bakterioen eta arkeoen hogeita zazpi espeziek 34.799 genomako bilduma konbinatzailea osatzen zuten (1b. irudia).
Ondoren, sortu berri den baliabidea ebaluatu dugu itsas mikrobioen komunitateak irudikatzeko duen gaitasuna hobetzeko eta genoma mota desberdinak integratzearen eragina ebaluatzeko.Batez beste, itsas metagenomiko datuen % 40-60 inguru estaltzen duela ikusi dugu (1c irudia), aurreko MAG-soilik egindako txostenen estalduraren bi edo hiru aldiz sakonera zein latitudean More serial 16 edo SAG20.Horrez gain, ezarritako bildumetan dibertsitate taxonomikoa sistematikoki neurtzeko, genoma guztiak ohartarazi genituen Genome Taxonomy Database (GTDB) tresna (metodoak) erabiliz eta %95eko batez besteko genoma osoko nukleotidoen identitatea erabili genuen.28 8.304 espezie multzo (espezie) identifikatzeko.Espezie hauen bi heren (klado berriak barne) ez ziren lehenago agertu GTDBn, eta horietatik 2790 ikerketa honetan berreraikitako MAG erabiliz aurkitu ziren (1d. irudia).Horrez gain, genoma mota desberdinak oso osagarriak direla ikusi dugu: espezieen % 55, % 26 eta % 11 oso-osorik MAG, SAG eta REFz osatuta daude, hurrenez hurren (1e. irudia).Horrez gain, MAG-ek ur zutabean aurkitutako 49 mota guztiak estali zituen, eta SAG eta REF, berriz, horietako 18 eta 11 baino ez ziren adierazten, hurrenez hurren.Hala ere, SAGk hobeto adierazten du klade arruntenen aniztasuna (hedatutako datuak, 3a. irudia), hala nola Pelagic Bacteriales (SAR11), SAG ia 1300 espezie hartzen ditu eta MAG 390 espezie bakarrik.Nabarmentzekoa, REFak oso gutxitan gainjartzen ziren MAG edo SAGekin espezie mailan eta hemen aztertutako ozeano irekiko metagenomiko multzoetan aurkitu ez diren 1000 genomaren % 95 baino gehiago ordezkatzen zuten, batez ere beste itsas ale adierazgarri isolatu batzuekiko elkarreraginengatik (adibidez, sedimentuak). .edo ostalari-elkartua).Komunitate zientifikoarentzat oso zabala izan dadin, itsas genomaren baliabide hau, sailkatu gabeko zatiak (adibidez, aurreikusitako fagoetatik, uharte genomikoetatik eta MAG berreraikitzeko datu nahikorik ez duten genoma zatiak) barne hartzen dituena, datu taxonomikoekin alderatu daiteke. .Atzitu oharrak geneen funtzioarekin eta testuinguruko parametroekin batera Ocean Microbiology Database-n (OMD; https://microbiomics.io/ocean/).
Ondoren, ozeano irekiko mikrobiometan biosintetiko potentzialaren aberastasuna eta berritasuna aztertzeari ekin genion.Horretarako, lehenengo antiSMASH erabili genuen 1038 itsas metagenometan (metodotan) aurkitutako MAG, SAG eta REF guztietarako, guztira 39.055 BGC aurreikusteko.Ondoren, hauek 6907 GCF ez-erredundanteetan eta 151 gene-multzo populaziotan (GCC; 2. taula osagarria eta metodoak) taldekatu ditugu, berezko erredundantzia (hau da, BGC bera genoma anitzetan kodetu daiteke) eta datu metagenomikoak BGC kontzentratuen zatiketa kontuan hartzeko.BGC osatugabeek ez zuten nabarmen handitu, halakorik bada (Informazio osagarria), kasuen % 44 eta % 86an gutxienez BGC kide osorik duten GCF eta GCC kopurua, hurrenez hurren.
GCC mailan, aurreikusitako RiPP eta beste produktu natural ugari aurkitu ditugu (2a. irudia).Horien artean, adibidez, arilpolienoak, karotenoideak, ektoinak eta sideroforoak banaketa filogenetiko zabala eta metagenoma ozeanikoetan ugaritasun handia duten GCCak dira, eta horrek mikroorganismoen egokitzapen zabala adieraz dezake itsas ingurunera, oxigeno-espezie erreaktiboekiko erresistentzia barne. estres oxidatiboa eta osmotikoa..edo burdinaren xurgapena (informazio gehiago).Aniztasun funtzional honek NCBI RefSeq datu-basean (BiG-FAM/RefSeq, hemendik aurrera RefSeq deritzona)29 (BiG-FAM/RefSeq, hemendik aurrera RefSeq)29 gordetako 190.000 genomaren artean gutxi gorabehera 1,2 milioi BGCren analisiarekin kontrajartzen du, zeinak erakutsi zuen sintetasa ez-ribosomiko peptidoak (NRPS) eta poliketido sintasa zirela. (PKS) BGCak (Informazio osagarria).44 (% 29) GCC ere aurkitu ditugu urruneko edozein RefSeq BGCrekin (\(\bar{d}\)RefSeq > 0,4; 2a irudia eta metodoak) eta 53 (%35) GCC MAG-en soilik, potentziala nabarmenduz. aurretik deskribatu gabeko produktu kimikoak detektatzeko OMDn.GCC horietako bakoitzak funtzio biosintetiko oso anitzak ordezkatzen dituela kontuan hartuta, GCF mailan datuak gehiago aztertu ditugu, antzeko produktu naturaletarako kodetzeko aurreikusitako BGCen taldeketa zehatzagoa eskaintzeko asmoz29.Guztira, identifikatutako 3861 (% 56) GCF ez ziren RefSeq-ekin gainjartzen, eta GCFen % 97 ez zeuden MIBiG-en, esperimentalki baliozkotutako BGCen datu-base handienetako batean (2b irudia).Erreferentziazko genomak ondo irudikatuta ez dauden inguruneetan bide berri potentzial asko aurkitzea harritzekoa ez den arren, BGCak GCF-ak benchmarken aurretik desreplicatzeko gure metodoa aurreko txostenetatik desberdina da 16 eta berritasunaren balorazio alboragabea emateko aukera ematen digu.Aniztasun berriaren gehiengoa (3012 GCF edo % 78) aurreikusitako terpenoei, RiPPri edo beste produktu natural batzuei dagokie, eta gehiena (1815 GCF edo % 47) mota ezezagunetan kodetzen da haien biosintetiko ahalmenagatik.PKS eta NRPS klusterrak ez bezala, BGC trinko hauek ez dira hain litekeena zatikatu metagenomiko muntaian zehar 31 eta denbora eta baliabide gehiago erabiltzen dituzten produktuen karakterizazio funtzional gehiago ahalbidetzen dute.
Guztira 39.055 BGC 6.907 GCF eta 151 GCCtan bildu ziren.a, datuen irudikapena (barne kanpokoa).GCCn oinarritutako BGC distantzien multzokatze hierarkikoa, horietako 53 MAG-ek soilik finkatzen ditu.GCC-k taxon ezberdinetako BGC (ln eraldatutako atearen maiztasuna) eta BGC klase ezberdinetakoak ditu (zirkuluaren tamaina bere maiztasunari dagokio).GCC bakoitzeko, kanpoko geruzak BGC kopurua, prebalentzia (laginen ehunekoa) eta distantzia (BGC kosinu distantzia minimoa (min(dMIBiG))) adierazten ditu BiG-FAMetik BGCra.Geziekin nabarmentzen dira esperimentalki egiaztatutako BGCekin (MIBiG) oso lotuta dauden BGCak.b GCF aurreikusitako (BiG-FAM) eta esperimentalki baliozkotutako (MIBiG) BGCekin alderatuz, 3861 GCF berri (d–>0,2) aurkitu ziren.Horietako gehienek (% 78) RiPP, terpeno eta beste produktu natural ustezko batzuentzat kodetzen dute.c, 1038 itsas metagenometan aurkitutako OMDko genoma guztiak GTDB oinarriko zuhaitzean jarri ziren OMDren estaldura filogenetikoa erakusteko.OMD-ko genomarik gabeko kladeak grisez agertzen dira.BGC kopurua klade jakin bateko genoma bakoitzeko aurreikusitako BGC kopuru handienari dagokio.Argitasuna lortzeko, azken nodoen % 15 tolestuta daude.Geziek BGC-n (>15 BGC) aberatsak diren kladeak adierazten dituzte, Mycobacterium, Gordonia (bigarrena Rhodococcus-en atzetik) eta Crocosphaera (bigarrena Synechococcus-en atzetik) izan ezik.d, Ezezaguna c.Eremiobacterotak dibertsitate biosintetiko handiena erakutsi zuen (Shannon indizea produktu natural motaren arabera).Banda bakoitzak espezieko BGC gehien dituen genoma adierazten du.T1PKS, PKS I mota, T2/3PKS, PKS II mota eta III mota.
Aberastasunaz eta berritasunaz gain, itsas mikrobiomaren potentzial biosintetikoaren egitura biogeografikoa aztertzen dugu.Laginak metagenomikoaren batez besteko GCF kopia-zenbakien banaketaren arabera (Metodoak) taldekatzeak erakutsi zuen latitude baxuko, azaleko, prokariotiko aberatsak eta birus-pobreak diren komunitateak, gehienbat azaleko edo eguzki-argiztatutako ur sakonagoetakoak, RiPP eta BGC terpenoetan aberatsak zirela.Aitzitik, polar, itsaso sakoneko, birus eta partikula aberatsak diren komunitateak NRPS eta PKS BGC ugaritasun handiagoarekin lotu ziren (datu hedatuak, 4. irudia eta informazio osagarria).Azkenik, ondo aztertutako komunitate tropikal eta pelagikoak terpeno berrien iturririk itxaropentsuenak direla ikusi dugu (Datuen irudia).PKS, RiPP eta beste produktu natural batzuen potentzial handiena (5a irudia datu zabalduekin).
Itsas mikrobiomen biosintetiko potentzialaren azterketa osatzeko, haien banaketa filogenetikoa mapatzea eta BGCz aberastutako klado berriak identifikatzea izan dugu helburu.Horretarako, itsas mikrobioen genomak GTDB13 bakterio eta arkeoen zuhaitz filogenetiko normalizatu batean kokatu ditugu eta haiek kodetzen dituzten bide biosintetiko ustezkoen gainjarri ditugu (2c. irudia).Erraz detektatu ditugu BGCz aberastutako hainbat klade (15 BGC baino gehiagok ordezkatuta) beren biosintetiko potentzialengatik ezagunak diren itsasoko ur laginetan (metodoetan), hala nola zianobakterioak (Synechococcus) eta Proteus bakterioak, Tistrella32,33 bezalakoak, edo duela gutxi arreta erakarri duten haiengatik. produktu naturalak.hala nola, Myxococcota (Sandaracinaceae), Rhodococcus eta Planctomycetota34,35,36.Interesgarria da klado hauetan orain arte esploratu gabeko hainbat leinu aurkitu ditugula.Adibidez, Planctomycetota eta Myxococcota filetan biosintetiko ahalmen aberatsena zuten espezieak ezaugarritu gabeko ordena hautagai eta generoetakoak ziren, hurrenez hurren (3. taula osagarria).Batera hartuta, OMD-k orain arte ezezaguna den informazio filogenetikorako sarbidea ematen duela iradokitzen du, mikroorganismoak barne, eta horrek entzimak eta produktu naturalak aurkitzeko helburu berriak izan ditzake.
Ondoren, BGC aberastutako kladoa ezaugarritu dugu bere kideek kodetutako BGC kopuru maximoa zenbatuz ez ezik, BGC horien aniztasuna ebaluatuz ere, produktu hautagai natural mota desberdinen maiztasuna azaltzen duena (2c. irudia eta metodoak). )..Azterketa honetan biosintetikoki anitzen diren espezieak bereziki diseinatutako bakterio-MAGek irudikatzen zituztela aurkitu genuen.Bakterio hauek Candidatus Eremiobacterota landu gabeko filumakoak dira, ikerketa genomiko gutxi batzuez gain ikertu gabe jarraitzen duena37,38.Aipagarria da “ca.Eremiobacterota generoa lurreko ingurunean soilik aztertu da39 eta ez da ezagutzen BGCn aberastutako kiderik barne hartzen duenik.Hemen espezie bereko zortzi MAG berreraiki ditugu (nukleotido-identitatea > % 99) 23. Horregatik, “Candidatus Eudoremicrobium malaspinii” espeziearen izena proposatzen dugu, greziar mitologian eta espedizioetan opari ederra den nereidaren (itsas ninfa) izena duena.'Ka.13. ohar filogenetikoaren arabera, E. malaspinii-k ez du sekuentzia mailatik beherako ahaide ezagunik eta, beraz, proposatzen dugun bakterio-familia berri bati dagokio “Ca.E. malaspinii” espezie mota gisa eta “Ca.Eudormicrobiaceae” izen ofizial gisa (Informazio osagarria).'Ca.E. malaspinii genomaren proiektua balioztatu zen sarrera oso baxuaren bidez, irakurketa luzeko sekuentziazio metagenomikoaren bidez eta lagin bakar baten (Metodoak) muntaketa bideratua 9,63 Mb-ko kromosoma lineal bakar gisa 75 kb-ko bikoizketaren bidez.geratzen den anbiguotasun bakarra bezala.
Espezie honen testuinguru filogenetikoa ezartzeko, hurbileko erlazionatutako 40 espezie bilatu ditugu Tara Ocean espedizioko eukariotoz aberastutako lagin metagenomiko gehigarrietan genomaren berreraikuntza zuzenduaren bidez.Laburbilduz, irakurketa metagenomikoak lotu ditugu "Ca.E. malaspinii” eta hipotesia egin zuen lagin honetan kontratazio-tasa handitzeak beste senide batzuen presentzia adierazten duela (metodoak).Ondorioz, 10 MAG aurkitu ditugu, definitutako familia berri baten barruan (hau da, "Ca. Eudormicrobiaceae") hiru generotako bost espezie ordezkatzen dituzten 19 MAGen konbinazioa.Eskuzko ikuskapena eta kalitate-kontrola egin ondoren (hedatutako datuak, 6. irud. eta informazio osagarria), “Ca.Eudormicrobiaceae espezieek "Ca" kideek baino genoma handiagoak (8 Mb) eta potentzial biosintetiko aberatsagoa (14 eta 22 BGC espezie bakoitzeko) aurkezten dituzte.Clade Eremiobacterota (gehienez 7 BGC) (3a-c. irudiak).
a, bost 'Ca-ren posizio filogenetikoak.Eudormicrobiaceae espezieek BGC aberastasuna erakutsi zuten ikerketa honetan identifikatutako itsas-lerroetarako.Zuhaitz filogenetikoak 'Ca.MAG Eremiobacterota eta GTDBn (89. bertsioa) emandako beste phyla (genoma-zenbakiak parentesi artean) kideak erabili ziren eboluzio atzeko planorako (Metodoak).Kanpoaldeko geruzek familia mailan (“Ca. Eudormicrobiaceae” eta “Ca. Xenobiaceae”) eta klase mailan (“Ca. Eremiobacteria”) sailkapenak adierazten dituzte.Ikerketa honetan deskribatutako bost espezieak kode alfanumerikoen eta proposatutako izen binomialen bidez adierazten dira (Informazio osagarria).b, ados.Eudormicrobiaceae espezieek zazpi BGC nukleo komun partekatzen dituzte.A2 kladean BGCrik ez egotea MAG ordezkariaren osotasunik ezaren ondorioz izan zen (3. taula osagarria).BGCak "Ca.Amphitomicrobium” eta “Ca.Amphitomicrobium” (A eta B kladoak) ez dira erakusten.c, BGC guztiak "Ca.Eudoremicrobium taraoceanii Tarako ozeanoetatik hartutako 623 metatranskriptometan adierazten zela aurkitu zen.Zirkulu sendoek transkripzio aktiboa adierazten dute.Zirkulu laranjak log2-eraldatutako tolestura-aldaketak adierazten dituzte etxeko geneen espresio-tasa (metodoak) azpitik eta gainetik.d, ugaritasun erlatiboaren kurbak (metodoak) 'Ca.Eudormicrobiaceae espezieak oso hedatuta daude ozeano-arro gehienetan eta ur-zutabe osoan (azaletik gutxienez 4000 m-ko sakoneraraino).Estimazio horietan oinarrituta, 'Ca.E. malaspinii'k zelula prokariotoen %6a hartzen du itsaso sakoneko ale pelagikoekin lotutako komunitateetan.Espezie bat aztarnategi batean presente dagoela kontsideratzen genuen, sakonera-geruza jakin baten tamainaren edozein zatitan aurkitzen bazen.IO – Indiako Ozeanoa, NAO – Ipar Atlantikoa, NPO – Ipar Pazifikoa, RS – Itsaso Gorria, SAO – Hego Atlantikoa, SO – Hego Ozeanoa, SPO – Hego Ozeanoa.
Ca-ren ugaritasuna eta banaketa aztertzea.Eudormikrobiazeoak, aurkitu dugun bezala, ozeano-arro gehienetan nagusitzen direnak, baita ur-zutabe osoan ere (3d. irudia).Lokalean, itsas mikrobioen komunitatearen % 6 osatzen dute, eta munduko itsas mikrobiomaren zati garrantzitsua da.Horrez gain, Ca-ren eduki erlatiboa aurkitu dugu.Eudormicrobiaceae espezieak eta haien BGC adierazpen-mailak altuenak izan ziren aberastutako frakzio eukariotoan (3c. irudia eta datu hedatuak, 7. irudia), materia partikularekin, planktona barne, interakzio posible bat adieraziz.Behaketa honek nolabaiteko antza du 'Ca.Bide ezagunen bidez produktu natural zitotoxikoak ekoizten dituzten Eudoremikrobium BGCek portaera harrapatzailea izan dezakete (Informazio osagarria eta datu hedatuak, 8. irudia), Myxococcus41 bezalako metabolitoak bereziki ekoizten dituzten beste harrapari batzuen antzera.Ca-ren aurkikuntza.Eudormicrobiaceae lagin eskuragarri gutxiagotan (ozeano sakonetan) edo eukariotoetan baino lagin prokariotikoetan azal dezakete zergatik geratzen diren bakterio horiek eta ustekabeko BGC aniztasuna elikagai naturalen ikerketaren testuinguruan.
Azken finean, bide, entzima eta produktu natural berriak ezagutzeko gure mikrobioman oinarritutako lanaren promesa esperimentalki balioztatu nahi izan dugu.BGC klase desberdinen artean, RiPP bideak dibertsitate kimiko eta funtzional aberatsa kodetzen duela ezagutzen da, entzima helduek nukleoaren peptidoaren itzulpen osteko hainbat aldaketengatik42.Beraz, bi aukeratu ditugu 'Ca.Eudoremicrobium' RiPP BGCak (3b eta 4a-e irudiak) edozein BGC ezagunen berdinean oinarritzen dira (\(\bar{d}\)MIBiG eta \(\bar{d}\)RefSeq 0,2tik gora).
a–c, In vitro heterologous expression and in vitro enzymatic assays of a novel (\(\bar{d}\)RefSeq = 0.29) cluster of a RiPP biosynthesis specific for deep sea Ca species.E. malaspinii'k produktu difosforilatuak ekoiztea ekarri zuen.c, bereizmen handiko (HR) MS/MS (egitura kimikoan b eta y ioiek adierazten duten zatiketa) eta RMN (datu hedatuak, 9. irudia) erabiliz identifikatutako aldaketak.d, peptido fosforilatu honek ugaztunen neutrofilo elastasaren inhibizio mikromolar baxua erakusten du, kontrol-peptidoan eta peptido deshidratatzailean ez dagoena (kentze kimikoak eragindako deshidratazioa).Esperimentua hiru aldiz errepikatu zen antzeko emaitzekin.Esaterako, proteina biosintesiaren bigarren \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33) multzo baten adierazpen heterologoak argitzen du 46 aminoazidoen nukleoaren peptidoa aldatzen duten lau entzima helduen funtzioa.Hondakinak HR-MS/MS, isotopoen etiketatzearen eta RMN analisiaren (Informazio osagarria) aurreikusitako aldaketa-gunearen arabera tindatzen dira.Marratxoen koloreak adierazten du aldaketa bi hondarren batean gertatzen dela.Irudia konstruktu heterologo ugariren bilduma bat da, nukleo berean entzima heldu guztien jarduera erakusteko.h, bizkarrezurreko amida N-metilaziorako NMR datuen ilustrazioa.Emaitza osoak irudian agertzen dira.10 datu hedatuekin.i, FkbM proteina-kluster entzimaren posizio filogenetikoak MIBiG 2.0 datu-basean aurkitutako FkbM domeinu guztien artean N-metiltransferasa jarduera duen familia honetako entzima bat erakusten du (Informazio osagarria).BGCen (a, e), peptidoen egitura aitzindarien (b, f) eta produktu naturalen ustezko egitura kimikoen (c, g) eskema-eskema erakusten dira.
Lehenengo RiPP bidea (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,41, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,29) itsaso sakoneko espezieetan bakarrik aurkitu zen "Ca.E. malaspinii” eta Peptide- aitzindariaren kodeak (4a, b. irudiak).Entzima heldu honetan, normalean fosforilazioa eta ondorengo 43 kentzea katalizatzen dituen lantipeptido sintetasaren deshidratazio-domeinuaren homologoa den domeinu funtzional bakarra identifikatu dugu (Informazio osagarria).Horregatik, aurreikusten dugu peptido aitzindariaren aldaketak bi urratseko deshidratazioa dakarrela.Hala ere, tandem masa-espektrometria (MS/MS) eta erresonantzia magnetiko nuklearraren espektroskopia (NMR) erabiliz, peptido lineal polifosforilatua identifikatu dugu (4c. irudia).Ustekabea izan arren, azken produktua dela onartzen duten hainbat froga-lerro aurkitu ditugu: bi ostalari heterologo ezberdin eta deshidrataziorik ez in vitro entseguetan, entzima helduaren deshidratazio katalitikoko gunean mutatutako gako-hondakinen identifikazioa.guztiak “Ca”k berreraikitakoak.E. malaspinii genoma (hedatutako datuak, 9. irudia eta informazio osagarria) eta, azkenik, fosforilatuaren produktuaren jarduera biologikoa, baina ez kimikoki sintetizatutako forma deshidratatua (4d. irudia).Izan ere, neutrofilo elastasiaren aurkako proteasa inhibitzaile mikromolar aktibitate baxua duela ikusi dugu, kontzentrazio-tartean erlazionatutako beste produktu natural batzuekin alderagarria (IC50 = 14,3 μM) 44 , eginkizun ekologikoa argitzeke dagoen arren.Emaitza horietatik abiatuta, bideari “foseptina” izendatzea proposatzen dugu.
Bigarren kasua 'Ca-ren RiPP bide konplexua da.Eudoremicrobium generoak (\(\bar{d}\)MIBiG = 0,46, \(\bar{d}\)RefSeq = 0,33) proteina produktu naturalak kodetzen zituela aurreikusi zen (4e. irudia).Bide hauek interes bioteknologiko berezia dute, BGC motz samarrek kodetutako entzimek ezarritako ezohiko aldaketa kimikoen dentsitatea eta barietateagatik45.Proteina hau aurretik karakterizatutako proteinetatik desberdina dela ikusi genuen, ez baititu bai polizeramiden NX5N motibo nagusia eta bai lantionina-begizta 46 .Adierazpen-eredu heterologo arrunten mugak gainditzeko, Microvirgula aerodenitrificans sistema pertsonalizatuarekin batera erabili ditugu bide helduen lau entzima (metodo) karakterizatzeko.MS/MS, isotopoen etiketatze eta RMN konbinazio bat erabiliz, entzima heldu hauek detektatu ditugu peptidoaren 46 aminoazidoen muinean (4f,g irudiak, datu hedatuak, 10-12 irudiak eta informazio gehigarria).Entzima helduen artean, FkbM O-metiltransferasa familiako kide baten 47 lehen agerpena ezaugarritu genuen RiPP bidean eta ustekabean aurkitu genuen entzima heldu honek bizkarrezurreko N-metilazioa sartzen duela (4h. irudia, i eta informazio gehigarria).Aldaketa hau NRP48 produktu naturaletan ezagutzen bada ere, amida-loturen N-metilazio entzimatikoa erreakzio konplexua baina bioteknologikoki esanguratsua49 da, orain arte RiPP borosinen familiarentzat interesgarria izan dena.Espezifikotasuna 50,51.Jarduera hau beste entzima eta RiPP-en familia batzuetan identifikatzeak aplikazio berriak ireki ditzake eta proteinen 52 aniztasun funtzionala eta haien dibertsitate kimikoa zabaldu.Identifikatutako aldaketetan eta proposatutako produktuaren egituraren ezohiko luzeraren arabera, "pythonamide" bide-izena proposatzen dugu.
Funtzionalki ezaugarritutako entzima familia batean ustekabeko entzimologia baten aurkikuntzak aurkikuntza berrietarako ingurumenaren genomikaren promesa erakusten du, eta sekuentzia-homologian bakarrik oinarritutako inferentzia funtzionalaren gaitasun mugatua ere erakusten du.Horrela, RiPP polifosforilatuen bioaktibo ez-kanonikoen txostenekin batera, gure emaitzek biologia sintetikoen ahaleginek baliabide intentsiboa baina balio kritikoa erakusten dute konposatu biokimikoen aberastasun funtzionala, aniztasuna eta ezohiko egiturak guztiz ezagutzeko.
Hemen mikrobioek kodetutako potentzial biosintetikoen sorta eta haien testuinguru genomikoa itsas mikrobioma globalean erakusten dugu, etorkizuneko ikerketak erraztuz, ondoriozko baliabidea komunitate zientifikoaren eskura jarriz (https://microbiomics.io/ocean/).Bere berritasun filogenetiko eta funtzionalaren zati handi bat MAGs eta SAGak berreraikitzean soilik lor daitekeela aurkitu dugu, batez ere etorkizuneko bioprospekzio ahaleginak gidatu ditzaketen mikrobio-komunitate gutxi erabilietan.Nahiz eta hemen zentratuko garen 'Ca.Eudormicrobiaceae" bereziki biosintetikoki "talentudun" leinu gisa, aurkitu gabeko mikrobiotan aurreikusten diren BGC askok ziurrenik aldez aurretik deskribatu gabeko entzimologiak kodetzen dituzte, ingurumenaren eta/edo bioteknologikoki ekintza esanguratsuak dituzten konposatuak ematen dituztenak.
Sekuentziazio-sakonera nahikoa duten ikerketa ozeanografiko eta denbora-serie nagusietako metagenomiko datu-multzoak sartu ziren itsas-arroetan, geruza sakonetan eta denboran zehar itsasoko mikrobio-komunitate globalen estaldura maximizatzeko.Datu multzo hauek (1. taula osagarria eta 1. irudia) Tarako ozeanoetan bildutako laginetatik metagenomika barne hartzen dute (aberastu birikoak, n=190; aberastu prokariotikoak, n=180)12,22 eta BioGEOTRACES espedizioa (n=480).Hawaiian Oceanic Time Series (HOT, n = 68), Bermuda-Atlantic Time Series (BATS, n = 62)21 eta Malaspina Expedition (n = 58)23.Zati metagenomiko guztien sekuentziazio-irakurketak kalitateagatik iragazi ziren BBMap (v.38.71) erabiliz, irakurketetatik sekuentziazio-egokitzaileak kenduz, kalitate-kontroleko sekuentziak (PhiX genomak) mapatutako irakurketak kenduz eta trimq=14, maq=20 erabiliz, irakurketa-kalitate txarra baztertzen du. maxns = 0 eta minlength = 45. Ondorengo analisiak QC irakurketekin exekutatu edo batu ziren zehaztuz gero (bbmerge.sh minoverlap=16).QC irakurketak normalizatu ziren (bbnorm.sh helburua = 40, minddepth = 0) metaSPAdes erabiliz eraiki aurretik (v.3.11.1 edo v.3.12 behar izanez gero)53.Lortutako aldamioen kontigak (aurrerantzean scaffoldak deitzen direnak) luzera (≥1 kb) iragazi ziren azkenean.
1038 lagin metagenomikoak taldetan banatu ziren, eta lagin-talde bakoitzeko, lagin guztien kalitate metagenomikoaren kontrol-irakurketak lagin bakoitzaren parentesiekin parekatu ziren bereizita, eta ondorioz, bikoteka parentesitutako taldeen irakurketa-kopuru hau sortu zen: Tara Marine Viruses - Aberastua (190×190 ), Prokarioto Aberastuak (180×180), BioGEOTRACES, HOT and BATS (610×610) eta Malaspina (58×58).Kartografia Burrows-Wheeler-Aligner (BWA) (v.0.7.17-r1188)54 erabiliz egin da, irakurketak bigarren mailako guneekin parekatzea ahalbidetzen duena (-a bandera erabiliz).Lerrokadurak iragazi ziren gutxienez 45 oinarriko luzera izan zezaten, % 97ko identitatea ≥97koa eta irakurketen % ≥ 80koa izan zezaten.Ondorioz, BAM fitxategiak MetaBAT2 (v.2.12.1)55 jgi_summarize_bam_contig_depths script-a erabiliz prozesatu dira talde bakoitzaren barneko eta lagin arteko estaldura eskaintzeko.Azkenik, parentesiak multzokatu ziren sentikortasuna areagotzeko, MetaBAT2 banaka exekutatuta –minContig 2000 eta –maxEdges 500-ekin lagin guztietan. MetaBAT2 erabiltzen dugu multzoko boxeolari baten ordez, proba independenteetan frogatu baita boxeolari bakarra eraginkorrena dela.eta normalean erabiltzen diren beste boxeolari batzuk baino 10 eta 50 aldiz azkarrago57.Ugaritasun-korrelazioen eragina probatzeko, ausaz hautatutako metagenomikaren azpilagin batek (10 Tara Ocean datu multzo bakoitzeko, 10 BioGEOTRACESentzat, 5 denbora serie bakoitzeko eta 5 Malaspinarako) laginak soilik erabili zituen.Barne laginak taldekatzen dira estalduraren informazioa lortzeko.(Informazio Gehigarria).
Ondorengo analisian (kanpoko) genoma gehigarriak sartu ziren, hots, Tara Oceans26 datu-multzoaren azpimultzo batetik eskuz hautatutako 830 MAG, GORG20 datu-multzoko 5287 SAG eta MAR datu-baseko datuak (MarDB v. 4) 1707 REF isolatuetatik eta 682 SAG) 27. MarDB datu-multzorako, eskuragarri dauden metadatuen arabera aukeratzen dira genomak, lagin motak adierazpen erregular honekin bat egiten badu: '[S|s]ingle.?[C|c]ell|[C|c]ulture| [I|i] isolatua'.
Edukiontzi metagenomiko bakoitzaren eta kanpoko genomaren kalitatea CheckM (v.1.0.13) eta Anvi'oren Lineage Workflow (v.5.5.0) erabiliz ebaluatu zen58,59.CheckM edo Anvi'o-k ≥50% osotasuna/osotasuna eta ≤10% kutsadura/erredundantzia adierazten badu, gorde zelula metagenomikoak eta kanpoko genomak gero aztertzeko.Puntuazio hauek batez besteko osotasuna (mcpl) eta batez besteko kutsadura (mctn) bateratu ziren, komunitatearen irizpideen arabera60 genomaren kalitatea sailkatzeko honela: kalitate handia: mcpl ≥ % 90 eta mctn ≤ % 5;kalitate ona: mcpl ≥ % 70, mctn ≤ % 10, kalitate ertaina: mcpl ≥ % 50 eta mctn ≤ % 10, arrazoizko kalitatea: mcpl ≤ % 90 edo mctn ≥ % 10.Ondoren, iragazitako genomak kalitate-puntuazioekin (Q eta Q') erlazionatu ziren, honela: Q = mcpl – 5 x mctn Q' = mcpl – 5 x mctn + mctn x (tentsioaren aldakortasuna)/100 + 0,5 x log[N50] .(dRep61n ezarria).
Datu-iturri eta genoma mota ezberdinen (MAG, SAG eta REF) arteko konparazio-analisia ahalbidetzeko, 34.799 genoma deserreferentziatu ziren genoma osoko batez besteko nukleotido-identitatean (ANI) dRep erabiliz (v.2.5.4).Errepikapenak)61 ​​% 95eko ANI atalaseekin28,62 (-comp 0 -con 1000 -sa 0.95 -nc 0.2) eta kopia bakarreko markatzaile-geneekin SpecI63 erabiliz, genomaren multzokatzea espezie mailan.DRep kluster bakoitzeko genoma adierazgarri bat aukeratu zen goian definitu den kalitate maximoaren (Q') arabera, espeziearen adierazgarritzat jo zena.
Kartografia-abiadura ebaluatzeko, BWA (v.0.7.17-r1188, -a) erabili zen OMDan dauden 34.799 genomekin 1038 irakurketa metagenomiko multzo guztiak mapatzeko.Kalitate kontrolatutako irakurketak mutur bakarreko moduan mapatu ziren eta ondoriozko lerrokadurak iragazi ziren ≥45 bp-ko luzera duten lerrokatzeak soilik gordetzeko.eta identitatea ≥%95.Lagin bakoitzaren bistaratze-ratioa filtrazioaren ondoren geratzen diren irakurketen ehunekoa da, kalitate-kontroleko irakurketen guztizko kopuruarekin zatituta.Planteamendu bera erabiliz, 1038 metagenometako bakoitza 5 milioi txertaketara murriztu zen (hedatutako datuak, 1c. irudia) eta GORG SAG-ekin bat egin zen OMD-n eta GEM16 guztietan.GEM16 katalogoan itsasoko uretatik berreskuratutako MAGs kopurua iturri metagenomikoen gako-kontsulten bidez zehaztu zen, itsasoko uraren laginak hautatuz (adibidez, itsas sedimentuekin ez bezala).Zehazki, "uretakoa" hautatzen dugu "ekosistema_kategoria", "itsasoa" "ekosistema_mota" gisa eta "habitat" iragazten dugu "ozeano sakona", "itsasoa", "itsaso ozeanikoa", "itsaso pelagikoa", "itsas-ura" gisa. “Ozeanoa”, “Itsasoko ura”, “Azaleko itsasoko ura”, “Azaleko itsasoko ura”.Honen ondorioz, 5903 MAG (734 kalitate handiko) 1823 OTUtan banatuta (ikustaldiak hemen).
Genoma prokariotikoak GTDB-Tk (v.1.0.2)64 erabiliz taxonomikoki ohartarazi ziren GTDB r89 bertsioaren 13. bertsioko parametro lehenetsiekin. Anvi'o erabili zen domeinuen iragarpenean eta ≥% 10eko erredundantzian eta erredundantzian ≤ 10ean oinarritutako genoma eukariotoak identifikatzeko.Espezie baten oharpen taxonomikoa bere genoma adierazgarrietako bat bezala definitzen da.Eukariotoak izan ezik (148 MAG), genoma bakoitza funtzionalki komentatu zen lehenengoz prokka (v.1.14.5)65 erabiliz, gene osoak izendatuz, "arkea" edo "bakterioak" parametroak behar bezala definituz, eta hori ez direnentzat ere jakinarazten da. gene kodetzaileak.eta CRISPR eskualdeak, beste ezaugarri genomiko batzuen artean.Adierazi aurreikusitako geneak kopia bakarreko markatzaile-gene unibertsalak (uscMG) identifikatuz fetchMG (v.1.2)66 erabiliz, esleitu ortholog-taldeak eta kontsultatu emapper (v.2.0.1)67 erabiliz eggNOG (v.5.0)68 oinarrituta.KEGG datu-basea (2020ko otsailaren 10ean argitaratua) 69. Azken urratsa proteinak KEGG datu-basearekin lotuz egin zen DIAMOND (v.0.9.30)70 erabiliz ≥70eko kontsulta eta gai-estaldurarekin.Emaitzak gehiago iragazi ziren NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline-ren arabera71 bit-tasa ≥ espero den gehienezko bit-abiaduraren % 50ean oinarrituta (esteka bera).Gene-sekuentziak ere erabili ziren sarrera gisa BGCak identifikatzeko genoman antiSMASH (v.5.1.0)72 erabiliz parametro lehenetsiekin eta kluster-leherketa ezberdinekin.Genoma eta ohar guztiak OMDn bildu dira sarean eskuragarri dauden testuinguruko metadatuekin batera (https://microbiomics.io/ocean/).
Aurretik deskribatutako metodoen antzera12,22 CD-HIT (v.4.8.1) erabili genuen OMDko bakterio eta arkeo genometatik > 56,6 milioi proteina kodetzen duten geneak %95eko identitate eta gene laburragoetan (%90eko estaldura)73 biltzeko. > 17,7 milioi gene multzoak.Sekuentzia luzeena aukeratu zen gene multzo bakoitzeko gene adierazgarri gisa.Ondoren, 1038 metagenomak > 17,7 milioi BWA (-a) klusterreko kideekin parekatu ziren eta ondorioz BAM fitxategiak iragazi ziren ehuneko ≥95eko identitatearekin eta ≥45 oinarriko lerrokadurarekin soilik gordetzeko.Luzera normalizatutako geneen ugaritasuna kalkulatu zen lehen lerrokadura berezi onenaren txertaketak zenbatuz eta ondoren, mapatutako txertatze lausoetarako, dagozkien xede-geneei zatiki-zenbaketa gehituz haien txertaketa bakarraren kopuruarekiko proportzionala.
OMD zabaldutako genomak («Ca. Eudormicrobiaceae»-ko MAG gehigarriekin, ikus behean) mOTUs74 metagenomic analysis tool database (v.2.5.1) mOTU erreferentzia datu-base hedatua sortzeko.Sei kopia bakarreko genoma (23.528 genoma) baino ez ziren bizirik iraun hamar uscMGetatik.Datu-basearen hedapenak 4.494 multzo gehigarri sortu zituen espezie mailan.1038 metagenoma mOTU parametro lehenetsiak erabiliz aztertu ziren (v.2).Guztira, 644 mOTU klusterretan (% 95 REF, % 5 SAG eta % 99,9 MarDBkoak) bildutako 989 genoma ez ziren detektatu mOTU profilak.Horrek MarDB genomaren itsas isolamenduaren hainbat iturri osagarri islatzen ditu (detektatu gabeko genoma gehienak sedimentuetatik, itsas ostalarietatik, etab.) isolatutako organismoekin lotuta daude.Ikerketa honetan ozeano irekiko ingurunean zentratzen jarraitzeko, beherako analisitik kanpo utzi genituen ikerketa honetan sortutako mOTU datu-base hedatuan detektatu edo sartu ez baziren.
MAG, SAG eta REF-en OMDko BGC guztiak (ikus goian) aldamio metagenomiko guztietan identifikatutako BGCekin konbinatu ziren (antiSMASH v.5.0, parametro lehenetsiak) eta BiG-SLICE (v.1.1) erabiliz (PFAM domeinua)75 ezaugarritu ziren.Ezaugarri hauetan oinarrituta, BGCen arteko kosinu-distantzia guztiak kalkulatu ditugu eta (batez besteko estekak) GCF eta GCCn multzokatu ditugu 0,2 eta 0,8ko distantzia-atalaseak, hurrenez hurren.Atalase hauek aurretik Euklidear distantzia75 erabiliz erabilitako atalaseen egokitzapena dira, kosinu-distantziarekin batera, eta horrek jatorrizko BiG-SLICE multzokatze-estrategiaren akatsen bat arintzen du (Informazio osagarria).
Ondoren, BGCak iragazi ziren aldamioetan kodetutako ≥ 5 kb bakarrik gordetzeko, lehen deskribatu bezala zatitzeko arriskua murrizteko16 eta 1038 metagenometan aurkitzen ez diren MarDB REF eta SAGak baztertzeko (ikus goian).Honen ondorioz, guztira 39.055 BGC kodetu ziren OMD genomak, eta 14.106 zati metagenomikoetan identifikatu ziren (hau da, MAG-etan konbinatu gabe).BGC "metagenomiko" hauek datu-basean harrapatu gabeko itsas mikrobiomaren biosintesi potentzialaren proportzioa kalkulatzeko erabili ziren (Informazio osagarria).BGC bakoitza funtzionalki ezaugarritu zen BiG-SCAPE76-n definitutako anti-SMASH edo produktu lodiagoen kategoriek definitutako produktu iragarleen arabera.Kuantifikazioan laginketa-alborapena ekiditeko (GCC/GCFren osaera taxonomikoa eta funtzionala, GCF eta GCCren distantzia erreferentzia datu-baseetara eta GCFren ugaritasun metagenomikoa), espezie bakoitzeko GCF bakoitzeko BGC luzeena soilik mantenduz, 39.055 BGC gehiago desbikoiztu ziren, guztira 17.689 BGC lortuz.
GCC eta GCFren berritasuna kalkulatutako datu-basearen (RefSeq datu-basea BiG-FAM)29 eta esperimentalki egiaztatutako (MIBIG 2.0)30 BGCren arteko distantzian oinarrituta ebaluatu zen.17.689 BGC adierazgarrietako bakoitzeko, dagokion datu-baserako kosinu-distantzia txikiena aukeratu dugu.Ondoren, gutxieneko distantzia hauek batez bestekoa (batez bestekoa) egiten da GCF edo GCCren arabera, dagokionaren arabera.GCF bat berritzat hartzen da datu-baserako distantzia 0,2 baino handiagoa bada, hau da, GCF (batez beste) eta erreferentziaren arteko bereizketa idealari dagokiona.GCC-rako, 0,4 aukeratzen dugu, hau da, GCFk definitutako atalasearen bikoitza, estekekin epe luzerako harremana blokeatzeko.
BGC-ren ugaritasun metagenomikoa bere gene biosintetikoen batez besteko ugaritasun gisa estimatu zen (anti-SMASHek zehaztutakoa) gene-mailako profiletatik eskuragarri.GCF edo GCC bakoitzaren metagenomiko ugaritasuna BGC adierazgarrien batura gisa kalkulatu zen (17.689tik).Ugaritasun-mapa hauek konposizio zelularra normalizatu ziren lagin bakoitzeko mOTU zenbaketa erabiliz, sekuentziazio-ahaleginak ere kontuan hartuta (datu hedatuak, 1d. irudia).GCF edo GCCren prebalentzia ugaritasuna > 0 duten laginen ehuneko gisa kalkulatu da.
Laginen arteko distantzia euklidearra GCF profil normalizatutik kalkulatu da.Distantzia hauek tamaina murriztu ziren UMAP77 erabiliz eta ondoriozko txertaketak gainbegiratu gabeko dentsitatean oinarritutako clustering egiteko erabili ziren HDBSCAN78 erabiliz.HDBSCANek erabiltzen duen kluster baterako gutxieneko puntu kopuru optimoa (eta, beraz, kluster kopurua), kluster-kide izateko probabilitate metatua maximizatuz zehazten da.Identifikatutako klusterrak (eta kluster horien ausazko azpilagin orekatu bat bariantzaren aldagai anitzeko analisi permutazionalean (PERMANOVA) alborapena kontuan hartzeko) distantzia euklidear murriztu gabekoekiko esangura probatu zen PERMANOVA erabiliz.Laginen batez besteko genomaren tamaina mOTU-ren ugaritasun erlatiboan eta genometako kideen estimatutako genomaren tamainaren arabera kalkulatu da.Bereziki, mOTU bakoitzaren batez besteko genoma-tamaina bere kideen genomaren tamainen batez besteko gisa kalkulatu zen osotasunerako zuzendutako (iragazi ondoren) (adibidez, 3 Mb-ko luzera duen % 75eko genoma osoa 4ko tamaina egokitua du. Mb).% ≥70 osotasuna duten genom ertainetarako.Ondoren, lagin bakoitzaren batez besteko genomaren tamaina ugaritasun erlatiboaren arabera haztaturiko mOTU genomaren tamainen batura gisa kalkulatu zen.
OMD-n genomarekin kodetutako BGCen iragazi multzo bat GTDB zuhaitz bakterio eta arkealetan erakusten da (≥ 5 kb-ko markoetan, 1038 metagenometan aurkitu ez diren REF eta SAG MarDB kenduta, ikusi goian) eta aurreikusitako produktuen kategoriak filogenetikoan oinarrituta. genomaren posizioa (ikus goian).Lehenik eta behin, datuak espezieka murriztu genituen, espezie horretan BGC gehien dituen genoma adierazgarri gisa erabiliz.Bistaratzeko, ordezkariak zuhaitz taldeetan banatu ziren, eta berriro ere, zelula-klado bakoitzeko, BGC kopuru handiena duen genoma hautatu zen ordezkari gisa.BGCz aberastutako espezieak (gutxienez > 15 BGC dituen genoma bat) gehiago aztertu ziren Shannon Aniztasun Indizea kalkulatuz, BGC horietan kodetutako produktu motetarako.Aurreikusitako produktu mota guztiak berdinak badira, hibrido kimikoak eta beste BGC konplexu batzuk (anti-SMAHek aurreikusitakoaren arabera) produktu mota berekoak direla kontsideratzen da, multzoko ordena edozein dela ere (adibidez, proteina-bacteriozina eta bakteriozina-proteoproteina fusioa). gorputza).hibridoa).
Malaspina MP1648 laginaren gainerako DNA (estimatua 6 ng dela), SAMN05421555 lagin biologikoari dagokiona eta Illumina SRR3962772 irakurketa metagenomiko multzoarekin bat datorrena irakurketa laburrerako, PacBio sekuentziazio protokoloaren arabera prozesatua, sarrera ultra baxuarekin PacBio kit SMRTbell gDNA laginaren anplifikazioa erabiltzeko kit (100-980-000) eta SMRTbell Express 2.0 txantiloiak prestatzeko kit (100-938-900).Laburbilduz, gainerako DNA moztu, konpondu eta araztu (ProNex aleak) Covaris (g-TUBE, 52104) erabiliz.Araztutako DNA ondoren liburutegiaren prestaketa, anplifikazioa, arazketa (ProNex aleak) eta tamaina aukeraketa (>6 kb, Blue Pippin) azken arazte urratsa (ProNex aleak) eta Sequel II plataforman sekuentziatu baino lehen.
Lehenengo bien berreraikuntza ca.MAG Eremiobacterota-rako, sei ANI gehiago >% 99 identifikatu genituen (3. irudian jasota daude), hasieran kutsadura-puntuazioetan oinarrituta iragazten zirenak (geroago geneen bikoizketa gisa identifikatu ziren, ikus behean).“Ca” izeneko erretilu bat ere aurkitu dugu.Eremiobacterota” hainbat ikerketetatik23 eta gure ikerketako zortzi MAGekin batera erabili zituen 633 eukariotiko aberastutako (>0,8 µm) laginetatik irakurketa metagenomikoetarako erreferentzia gisa, BWA (v.0.7.17) Erref. -r1188, – bandera bat) azpilaginak egiteko. mapping (5 milioi irakurketa).Aberasterako berariazko mapetan oinarrituta (% 95eko lerrokatze-identitatearen arabera iragazita eta % 80ko irakurketa-estaldura), 10 metagenoma (espero den estaldura ≥5×) muntatzeko eta 49 metagenoma gehiago (espero den estaldura ≥1×) edukien korrelaziorako.Goiko parametro berberak erabiliz, lagin hauek ontziratu eta 10 'Ca gehigarri gehitu ziren.MAG Eremiobacterota zaharberritu da.16 MAG hauek (datu-basean dauden biak zenbatu gabe) zabaldutako OMD-ko genoma kopurua 34.815era eramaten dute.MAGei maila taxonomikoak esleitzen zaizkie GTDBn duten antzekotasun genomikoaren eta posizioaren arabera.18 MAG deserreplikatu ziren dRep erabiliz familia bereko 5 espezietan (ANI intraespezifiko >% 99) eta 3 generotan (ANI intragenerikoa % 85-% 94).Espezieen ordezkariak eskuz hautatu ziren osotasunaren, kutsaduraren eta N50aren arabera.Iradokitako nomenklatura Informazio Osagarrian dago.
'Ca.ren osotasuna eta kutsadura baloratzea.MAG Eremiobacterota, uscMG-ren presentzia ebaluatu dugu, baita CheckM-ek eta Anvio-k erabilitako kopia bakarreko markatzaileen leinu eta domeinu espezifikoen multzoak ere.40 uscMGetatik 2 bikoiztuen identifikazioa berreraikuntza filogenetikoarekin baieztatu zen (ikus behean) balizko kutsaduraren bat baztertzeko (% 5ari dagokio 40 gene markatzaile hauetan oinarrituta).Bost MAG ordezkariren azterketa gehigarri bat 'Ca.Berreraikitako genoma hauetako kutsatzaile maila baxua Eremiobacterota espezieentzat baieztatu zen Anvi'o interfaze interaktiboa erabiliz ugaritasun eta sekuentzia-konposizio korrelazioetan oinarrituta (Informazio Osagarria)59.
Analisi filogenomikorako, bost MAG adierazgarri aukeratu ditugu "Ca".Eudormicrobiaceae”, espezie guztiak “Ca.Eremiobacterota eta beste phyla batzuen (UBP13, Armatimonadota, Patescibacteria, Dormibacterota, Chloroflexota, Cyanobacteria, Actinobacteria eta Planctomycetota barne) genoma GTDB-n (r89)13 eskuragarri dago.Genoma horiek guztiak kopia bakarreko markatzaile geneen erauzketarako eta BGC ohartarazpenerako aldez aurretik deskribatu bezala adierazi ziren.GTDB genomak aurreko osotasun eta kutsadura irizpideen arabera kontserbatu ziren.Analisi filogenetikoa Anvi'o Phylogenetics59 lan-fluxua erabiliz egin da.Zuhaitza IQTREE (v.2.0.3) (lehenetsitako aukerak eta -bb 1000)80 erabiliz eraiki zen Anvi'ok (MUSCLE, v.3.8.1551)81 identifikatutako 39 tandem proteina erribosomikoen lerrokadura batean.Bere postuak murriztu egin ziren.genomaren %50 gutxienez estaltzeko82 eta Planctomycecota GTDB zuhaitz-topologian oinarritutako kanpoko talde gisa erabili zen.40 uscMGko zuhaitz bat eraiki zen tresna eta parametro berdinak erabiliz.
Traitar (v.1.1.2) parametro lehenetsiekin (fenotipoa, nukleotidoetatik)83 erabili dugu mikrobio-ezaugarri arruntak aurreikusteko.Aurretik garaturiko harrapari-indize84 batean oinarritutako balizko bizimodu harrapari bat aztertu genuen, genoman proteina kodetzen duen gene baten edukiaren araberakoa dena.Zehazki, DIAMOND erabiltzen dugu genomaren proteinak OrthoMCL datu-basearekin alderatzeko (v.4)85 aukerak erabiliz –sentikorragoa –id 25 –kontsulta-azalera 70 –gaiaren azala 70 –top 20 ETA dagozkion geneak zenbatu. harrapari eta ez harraparien gene markatzaileak.Indizea marka harraparien eta ez-harrapatzaileen arteko aldea da.Kontrol gehigarri gisa, “Ca” genoma ere aztertu dugu.Entotheonella TSY118 faktorea Ca-rekin duen loturan oinarritzen da.Eudoremikrobioa (genomaren tamaina handia eta biosintetiko potentziala).Ondoren, harrapari eta ez-harraparien markatzaile geneen eta Ca-ren potentzial biosintetikoen arteko lotura potentzialak probatu ditugu.Eudormicrobiaceae” eta ikusi zuen gene bat baino gehiago (edozein motatako gene markatzailekoa, hau da, harrapari/harrapari ez den genea) BGCrekin gainjartzen dela, BGCk ez dituela harrapari seinaleak nahasten.Nahasitako erreplikonen ohar genomiko gehigarria TXSSCAN (v.1.0.2) erabiliz egin zen jariatze sistema, pili eta flageloak zehazki aztertzeko86.
Bost 'Ca' adierazgarri mapatu ziren Tara ozeanoetako aberaste-frakzio prokariotikoen eta eukariotikoen 623 metatranskriptoma mapatuz22,40,87 (BWA, v.0.7.17-r1188, -a bandera erabiliz).Eudormicrobiaceae genoma.BAM fitxategiak FeatureCounts (v.2.0.1)88rekin prozesatu ziren % 80ko irakurketa-estaldura eta % 95eko identitate-iragazkia egin ondoren (aukerekin featureCounts -primaria -O -frakzioa -t CDS,tRNA -F GTF -g ID -p ) gene bakoitzeko txertatze kopurua.Sortutako mapak gene-luzerarako eta gene markatzaileen ugaritasunaren mOTU (luzera normalizatuaren batez besteko txertatze-zenbaketa > 0 duten geneetarako) normalizatu ziren eta 22,74 log-eraldatu ziren gene maila bakoitzeko zelula bakoitzeko adierazpen erlatiboa lortzeko, eta horrek ere azaltzen du. sekuentziazioan lagin batetik laginera aldakortasuna.Ratio horiek analisi konparatiboak ahalbidetzen dituzte, konposizio-arazoak arinduz ugaritasun erlatiboaren datuak erabiltzean.10 mOTU markatzaile-geneetatik > 5 dituzten laginak bakarrik aztertu ziren azterketa gehiago egiteko, genomaren zati aski handia detektatzeko.
Transcriptoma profil normalizatua 'Ca.E. taraoceanii dimentsio-murrizketa jasan zuten UMAP erabiliz eta ondoriozko irudikapena gainbegiratu gabeko clustering-erako erabili zen HDBSCAN (ikus goian) adierazpen-egoera zehazteko.PERMANOVAk identifikatutako klusterren arteko desberdintasunen garrantzia probatzen du jatorrizko (ez murriztu) distantzia-espazioan.Baldintza horien arteko adierazpen diferentziala probatu zen genoman zehar (ikus goian) eta 201 KEGG bide identifikatu ziren 6 talde funtzionaletan, hau da: BGC, jariatze sistema eta TXSSCANeko gene flagelarrak, degradazio entzimak (proteasa eta peptidasak) eta harrapariak eta ez-. gene harrapariak.harrapari-indize-markatzaileak.Lagin bakoitzerako, klase bakoitzeko espresio normalizatuaren mediana kalkulatu dugu (kontuan izan BGC adierazpena bera BGC horren gene biosintetikoen medianaren adierazpen gisa kalkulatzen dela) eta estatuen arteko esangura probatu dugu (Kruskal-Wallis proba FDRrako egokitua).
GenScript-en gene sintetikoak erosi ziren eta PCR lehenak Microsynth-en erosi ziren.Thermo Fisher Scientific-eko Phusion polimerasa DNA anplifikatzeko erabili zen.NucleoSpin plasmidoak, NucleoSpin gel eta Macherey-Nagel-en PCR arazketa kit erabili ziren DNA arazteko.Murrizketa entzimak eta T4 DNA ligasa New England Biolabs-i erosi ziren.Isopropyl-β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) (Biosynth) eta 1,4-dithiothreitol (DTT, AppliChem) ez diren beste produktu kimikoak Sigma-Aldrich-i erosi eta gehiago arazketarik gabe erabili ziren.Kloranfenikola (Cm), espektinomizina diklorhidratoa (Sm), anpizilina (Amp), gentamizina (Gt) eta karbobenizilina (Cbn) AppliChem-i erosi ziren.Bacto Tryptone eta Bacto Yeast Extract euskarrien osagaiak BD Biosciences-i erosi zizkion.Sekuentziatzeko tripsina Promegari erosi zitzaion.
Gene-sekuentziak SMASHen aurkako BGC 75.1 aurreikusitakotik atera ziren.E. malaspinii (Informazio osagarria).
Gene EMBA (Locus, Mala_Samn05422137_Metag-Framework_127-gene_5), embm (locus, mala_samn05422137_metag-farmwork_127-gene_4), eta enbam (intergene eskualdeak) PUC7 (AMPR) sintetikoak izan ziren, e-n adierazpenetarako optimizatutako koderik gabe noiz.embA genea pACYCDuet-1 (CmR) eta pCDFDuet-1 (SmR) lehen klonatze gune anitzetan (MCS1) azpiklonatu zen, BamHI eta HindIII zatiketa guneekin.EmbM eta embMopt geneak (kodoiarekin optimizatuta) MCS1 pCDFDuet-1 (SmR) azpiklonatu ziren BamHI eta HindIII-rekin eta pCDFDuet-1 (SmR) eta pRSFDuet-1 (KanR) (MCS2)-ren bigarren klonazio gune anitzetan jarri ziren. NdeI/ChoI.EmbAM kasetea pCDFDuet1 (SmR) azpiklonatu zen BamHI eta HindIII zatiketa guneekin.Orf3/embI genea (locus, MALA_SAMN05422137_METAG-scaffold_127-gene_3) gainjarritako hedapenaren PCR bidez eraiki zen EmbI_OE_F_NdeI eta EmbI_OE_R_XhoI abiarazleak erabiliz, NdeI/XhoI-rekin digeritua eta pMCDF-M enb-m enb-en bidez mugatuta (p1CDF) (Osagarria taula).6).Murrizketa entzimaren digestioa eta loketa fabrikatzailearen protokoloaren arabera (New England Biolabs) egin zen.