310 10 * 1 mm altzairu herdoilgaitzezko hodi kimikoko osagai kimikoak, spidroinaren N-terminal domeinuek amiloide fibriletan oinarritutako hidrogelak osatzen dituzte eta proteina immobilizatzeko plataforma eskaintzen dute.

Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.CSS laguntza mugatua duen arakatzailearen bertsioa erabiltzen ari zara.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Horrez gain, etengabeko laguntza bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe erakusten dugu.
Diapositiba bakoitzeko hiru artikulu erakusten dituzten graduatzaileak.Erabili atzeko eta hurrengo botoiak diapositibetan zehar mugitzeko, edo amaierako diapositiba kontroladorearen botoiak diapositiba bakoitzean mugitzeko.

Zehaztapena

310 10 * 1 mm altzairu herdoilgaitzezko hodi hornitzaile hornitzaileak

Konposizio Kimikoa

Propietate Mekanikoak

Armiarma-zetaren proteina birkonbinatzaileek (armiarma-zeta-proteinak) aplikazio potentzial asko dituzte biomaterial berrien garapenean, baina haien izaera multimodala eta agregazio-jokoa lortzeko zailak eta erabiltzeko errazak egiten ditu.Hemen adierazten dugu miniaturazko spidroin proteina birkonbinatzaileek eta, batez ere, N-terminal domeinuak (NT) berak azkar sortzen dituztela hidrogel auto-sostengatzaileak eta gardenak 37 °C-tan.NT eta proteina fluoreszente berdez edo purin nukleosido fosforilasaz osatutako fusio-proteinek fusio-proteina guztiz funtzionalak osatzen dituzte.Hidrogelak.Gure emaitzek erakusten dute NT eta fusio-proteina birkonbinatzaileek adierazpen errendimendu handiak ematen dituztela eta hidrogelei propietate erakargarriez hornitzen dietela, hala nola, gardentasuna, gurutzaketarik gabeko gelifikazioa eta proteina aktiboen inmobilizazio zuzena dentsitate handian.
Armiarmak zazpi zeta-guruin multzo ezberdin dituzte, bakoitzak zeta mota zehatz bat sortzen du.Zazpi zeta-espezie guztiak armiarma zetazko proteinez (spidroins) osatuta daude gutxi gorabehera 6000 hondar luze eta erdiko errepikapen-eskualde handi bat dute N- eta C-terminal domeinu esferikoz inguratuta (NT eta CT)1,2.Gehien aztertutako zeta mota, anpulu primarioa, anbula primarioko guruinek ekoizten dute.Guruin honetan, zelula epitelialen monogeruza batek spidroin proteinak sintetizatzen ditu eta guruinaren lumenean jariatzen ditu, non forma disolbagarrian (dopina) kontzentrazio oso altuetan (% 30-50 p/v)3,4.Guruinan spidroin proteina ampullar nagusien antolaketa eta konformazioa eztabaidatu da, baina ebidentzia esperimental gehienek adierazten dute orokorrean helikoide edo/eta ausazko konformazio helikoidala eta mizelar edo lamelar egiturak daudela5,6,7,8,9,10.Domeinu errepikakorrek zeta-zuntzen propietate mekanikoak erregulatzen dituzten bitartean, β xafla nanokristalak eta egitura amorfoak osatuz11,12,13,14,15, amaierako domeinuek zeta-zuntzak erregulatzen dituzte zeta-guruinaren baldintza aldakorrei erantzuteko16,17,18.Zetaren eraketa kontrolatuz, 19. Domeinu terminalak ebolutiboki kontserbatzen dira eta haien funtzioa spidroin proteina guztietan komuna izan daiteke 2,20,21.Guruinetik igarotzean, spidroinaren pHa gutxi gorabehera 7,6tik < 5,716ra jaisten da eta pixkanaka-pixkanaka estutzen den hodiaren mugimenduaren bitartez ebakidura eta luzamenduarekin handitzen da.Disoluzioan, CT dimero paralelo eratzaile α-helidal bat da17, baina pH eta ebakidura-indar baxuei erantzunez, CT β-geruzak zabaltzen eta aldatzen ditu16, 17, agian β-geruzak abiaraziz Bihurtu 16-ren eskualde errepikakorretan. NT pean monomerikoak dira. guruinaren lumen baldintzak islatzen dituzten baldintzak eta spidroinaren disolbagarritasuna bideratzen dute, baina pH murriztuan, azido karboxiliko alboko kate batzuen protonazioak NTren dimerizazioa dakar 6,5 pKa, gutxi gorabehera, NT egonkortuz eta spidroina handietan finkatuz. kantitateak.sareak16,18.Hortaz, NTk funtsezko eginkizuna du harizpien eraketan, estaldurako monomero batetik zuntzetan dimero batera igaroz23,24,25.NT oso disolbagarria eta helikoidala izaten jarraitzen du orain arte aztertutako baldintza guztietan16, 18, 19, 20, 26, 27, 28, 29, eta horrek proteina heterologoak ekoizteko disolbagarritasuna hobetzeko etiketa gisa garatu zuen.
Mini armiarma zetaren proteina birkonbinatzailea, NT bat, errepikapen laburreko eskualde bat, CT bat eta His6 etiketa bat (His-NT2RepCT) araztearekin osatua, ur-buffer uretan disolbagarria da armiarma zetazko proteina bertakoa bezain disolbagarria eta zetazko armiarmaren jatorrizko ezaugarri garrantzitsuak imitatzen ditu. .estaldura 25.31.His-NT2RepCT zuntz jarraituetan bira daiteke makina biomimetiko baten bidez, zeinetan pH 8ko estaldura disolbagarria pH 525,32,33,34,35 ur-bainu batean estruitzen den.His-NT2RepCT adierazten duen E. coli-ren bioerreaktorearen hartzidurak eta ondorengo tratamenduak > 14 g/L etekina lortu zuen arazketa ondoren.His-NT2RepCT-ren etekin handia, disolbagarritasun handia eta baldintza azidoekiko erantzun egokia NT23, 25, 34-i egozten zaie.
Hemen spidroin proteina birkonbinatuen hidrogel gardenen eraketa azkarraren berri ematen dugu, NT bakarrik barne, proteina-soluzio bat 37 °C-tan inkubatuz.Tioflabina T fluoreszentzia (ThT), Fourier transformatu infragorrien espektroskopia (FTIR), erresonantzia magnetiko nuklear espektroskopia (NMR) eta transmisiozko mikroskopia elektronikoa (TEM) erabiliz, NT eta mikroarmiarma proteinak egiturazko eraldaketa jasaten dutela β xafla eta amiloide antzeko fibriletan aurkitu dugu. gelak sortzen direnean.Horrez gain, NT eta proteina fluoreszente berdearen (GFP) edo purin nukleosido fosforilasaren (PNP) fusio-proteinek fusio-zati guztiz funtzionalak dituzten hidrogelak eratzen dituzte.Ostalari heterologoetan errendimendu handiko adierazpenak, baldintza fisiologikoetan hidrogelen eraketa azkarrarekin batera, ingeniaritza funtzioak dituzten hidrogelak kostu-eraginkorra ekoizteko aukera zabaltzen du.
Spidroin proteina birkonbinatzaile gehienek ez bezala36, His-NT2RepCT egonkorra da Tris-HCl tamponean 8 pH-an eta 500 mg/ml-ra arte kontzentratu daiteke prezipitaziorik gabe25.Hori dela eta, harritu egin ginen proteina honek 37 °C-tan inkubatzen direnean hidrogel optikoki argi eta autosostengatzaileak azkar sortzen dituela (1b-d irudia).Ikerketa gehiagok erakutsi zuten His-NT2RepCT gelazioa proteina-kontzentrazio zabal batean gertatu zela (10-300 mg/mL) eta kontzentrazio hori gelifikazio denborarekin alderantziz erlazionatuta zegoela (1c. irudia eta 1. irudi osagarria).His-NT2RepCT-ren zein zatik hidrogelaren eraketa bitartekari duten jakiteko, domeinu bakoitza banan-banan eta hainbat konbinaziotan aztertu genuen matrazearen inbertsio-saioa erabiliz (1a, b irudia).Testatutako spidroin birkonbinatzailearen frakzio guztiek gelak sortu zituzten (300 mg/mL-ko proteina-kontzentrazioan) ordu 1 baino gutxiagoan, 2Rep prezipitatua izan ezik (1b. irudia).Horrek iradokitzen du NT eta CT bakarrik, konbinatuta edo errepikapenekin lotuta, 37 °C-tan gelifikatu daitezkeela eta His6 etiketak ez duela prozesu honetan eragin nabarmenik.NT proteina oso disolbagarria eta egonkorra dela eta spidroin hidrogel birkonbinatzaileen aurreko txostenek gelifikazio-efektuak egotzi dizkietela errepikatutako eskualdeetan eta/edo CTetan konformazio-aldaketari, NTk berak egin dezake.Gelazioaren aurkikuntza ezustekoa izan zen.Taula osagarria 1) 37, 38, 39. Nabarmentzekoa, NT jada gelifikatu zen 10 minuturen buruan ≥ 300 mg/mL-ko kontzentrazioan (1c. irudia).NT-ren hainbat kontzentraziorekin egindako ontzien inbertsio-esperimentuek > 50 mg/mL-tan NT disoluzioa His-NT2RepCT baino azkarrago gelifikatzen zela erakutsi zuten dagokion kontzentrazioan (w/v, 1c irudia).
Lan honetan aztertutako hainbat spidroin-eraikuntzaren irudikapen eskematikoa.b Gel-denbora 37 °C-tan espidroin proteina birkonbinatzaile ezberdinentzat (300 mg/mL) fiala alderantziz egiaztatuta.CT gel berehala inkubaziorik gabe (<300 mg/mL), 2Rep prezipitatuak (300 mg/mL, 5 mm-ko eskala).c His-NT2RepCT eta NT-ren gel-denbora adierazitako proteina-kontzentrazioetan 37 °C-tan.d His-NT2RepCT eta NT hidrogelen argazkiak azpian armiarma eta "NT" letra inprimatuta dituztela, hurrenez hurren (biak 200 mg/mL, eskala-barra 5 mm).
Spidroin proteina birkonbinatzaile ezberdinek osatutako hidrogelek kolore apur bat desberdinak dituzte, eta begi hutsez egindako behaketak gardentasun maila desberdinak erakusten ditu (1b. irudia).NT gelak oso argiak dira, beste gelak opakuak bihurtzen diren bitartean.Hodi zilindrikoetan botatako His-NT2RepCT eta NT gelak moldetik osorik atera litezke (1d. irudia).
Armiarmaren zetazko estaldura naturalak gelifikatzen dituen ala ez probatzeko, orain spidroin proteina birkonbinatuen gelifikazioa eragiten duten baldintzetan, estaldurak bildu ziren Suediako zubi-armiarmaren (Larinioides sclopetarius) anbula-guruin handitik.Estaldurak 20 mM Tris-HCl tamponean gorde ziren 50 mg/mL-tan (neurtutako pisu lehorrean oinarrituta), baina ez zen gelifikaziorik ikusi 21 eguneko inkubazioan 37 °C-tan (2a irudi osagarria).
Gel hauek kuantifikatzeko, neurketa erreologikoak erabil daitezke gelifikazio-prozesua aztertzeko eta propietate mekaniko orokorrak zehazteko.Bereziki, tenperatura altuetan biltegiratze-modulua (elastikotasuna) kontrolatzeak gelifikazio-tenperaturari eta estalduraren propietate biskoelastikoei buruzko informazioa eman dezake.Tenperatura igoeraren esperimentuek (1 °C/min erabiliz 25-45 °C-tan, zetazko soluzio naturalak erabiliz aurreko ikerketetan oinarrituta)40,41 erakutsi zuten His-NT2RepCT eta NT soluzioen biltegiratze-modulua handitzen zela tenperatura handituz.handitu egin zen (2. irudia eta 3. irudi osagarria).Nabarmentzekoa, NT modulua tenperatura baxuagoan hazten hasi zen His-NT2RepCTrekin alderatuta, NT His-NT2RepCTrekin zuzenean inkubatuta 37 °C-tan ikusitako gel-denbora azkarragoarekin bat datorrena (1. irudia).Ondoren tenperatura jaitsi ondoren, biltegiratze-modulua ez zen balio baxuagoetara itzuli eta galera-moduluaren gainetik geratu zen (ikus 3. irudi osagarria), termikoki itzulezina den gelifikazio egonkorra adieraziz.Gelifikazioaren ondoren, azken modulu elastikoa 15 eta 330 kPa bitartekoa zen His-NT2RepCT hidrogelentzat 100-500 mg/mL-ko kontzentrazioan, eta azken modulu elastikoa NT hidrogelentzat (100-500 mg/mL) 2 eta 1400 bitartekoa izan zen. kPa (irudia, 2 eta arrapalaren datu osoa) ikus 3. irudi osagarria).
a Tenperatura aldaketa His-NT2RepCT (300 mg/mL) eta b NT (300 mg/mL) neurketetan dardararekin.Geziek tenperaturaren joera adierazten dute, eta biltegiratze-moduluaren datuen itzal arinagoak fabrikatzaileak zehaztutakoak baino pare-balio baxuagoetan egiten diren probak erakusten ditu, hau da, zarata handitzearen kausa.c His-NT2RepCT eta NT-ren amaierako moduluaren metaketa tenperatura altxatu ondoren (100, 300 eta 500 mg/mL).Moduluaren irakurketa guztiak 0,1 Hz-ko maiztasunean hartzen dira.
Gelazioari lotutako konformazio-aldaketak ikertzeko metodo potentzial gisa, His-NT2RepCT eta NT-ren FTIR espektroak 37 ° C-tan gelifikatu aurretik eta ondoren grabatu genituen (3a, b irudia).Espero zen bezala, His-NT2RepCT eta NT soluzioen espektroak α-helize/ausazko bobinaren egitura sekundarioa erakusten duten proteinei dagozkie, 1645 cm-1-ko banda nabarmen batekin.Bi hidrogelentzat, gelizazioak erdiko I bandan bi besoak sortu zituen 1617 cm-1 eta 1695 cm-1 inguruan (3a, b irudiak), paraleloen aurkako β xafla egiturak eratu zirela adieraziz.Aldaketa hauek dagozkien bigarren deribatuaren eta diferentziaren gelifikazio-espektroetan ere argi ikus daitezke (4b irudi osagarria).NT β-geruzaren bi bandak His-NT2RepCTrenak baino nabarmenagoak ziren, NT hidrogelaren β-geruzaren banden eduki osoa NT2RepCT hidrogelarena baino handiagoa zela adierazten du.
a His-NT2RepCT eta b NTren FTIR xurgapen espektroak (biak 500 mg/mL) (disoluzioa) eta (gel) 37 °C-tan inkubatu aurretik.c 50 mg/ml berriro esekitako NT2RepCT gelen eta d NTren TEM irudiak.Eskala-barra 200 nm.e His-NT2RepCT eta NT hidrogelen zuntz-diametroak.n = neurtutako fibrila 100, p < 0,0001.Errore-barrak desbideratze estandarra erakusten dute.Errore-barren erdigunea batez bestekoa da.Parekatu gabeko t-test bat (bi buztanekoa) erabili zen azterketa estatistikorako.f ThT spidroin proteina birkonbinatuen (100 mg/mL) fluoreszentzia 37 °C-tan astindu gabe.g NT (100 mg/mL) 100 mg/mL NT gelaren inokulazio-esperimentuak % 0, % 5, % 10 eta % 20 haziekin.
Gelaren analisiak transmisiozko mikroskopia elektronikoa (TEM) erabiliz erakutsi zuen hidrogela amiloide antzeko fibrilez osatuta dagoela (3c, 3d irudiak).NT-k eratutako fibrilak luzangakoak ziren (5-12 nm-ko diametroa) eta adargabeak ziren, His-NT2RepCT fibrilak luzera laburragoak ziren eta diametroa nabarmen zabalagoak ziren (7-16 nm) (3e. irudia).Emaitza horiei esker, fibrosiaren zinetika jarraitu ahal izan dugu tioflabina T (ThT) saiakuntza erabiliz.Spidroin proteina birkonbinatzaile guztietarako, seinale fluoreszentea handitu egin zen laginak 37 °C-tan inkubatu zirenean (3f. irudia, 5a irudi osagarria).Aurkikuntza honekin bat etorriz, NT eta His-NT2RepCT-ren azterketa mikroskopikoak gelifikazio-baldintzetan ThT fluoreszentziaren gehikuntza uniformea ​​agerian utzi zuen ThT-ko agregatuen tokiko metaketa nabaririk gabe (5b, c irudi osagarria).ThT-positiboen fibrilen eraketa ez zen NT eta His-NTCT uhertasunaren gehikuntzarekin (5d. irudi osagarria), hau da, gelan fibrilen sare bat sor zitekeela gelaren argitasuna kaltetu gabe.Aurrez eratutako fibrilen kantitate txikiak gehituz haziak amiloide batzuen fibrilen eraketa nabarmen bizkortu dezake42,43,44, baina %5, %10 edo %20 (p/w) NT gehituz NT hidrokoagulatzaileen disoluzioari.hazi efektua (3g. irudia).Agian hau hidrogelaren fibrilak nahiko finkoak direlako eta ezin direla hazi gisa erabili.
Spidroin proteina birkonbinatuen ustekabeko portaerak tenperatura altuetan erresonantzia magnetiko nuklear (NMR) espektroskopia azterketa gehiago bultzatu zituen gelen eraketarekin lotutako konformazio-aldaketak identifikatzeko.37 °C-tan denboran grabatutako His-NT2RepCT soluzioen EMN espektroek erakutsi zuten CT partzialki tolestuta zegoela oraindik, eta NT eta 2Rep seinaleak desagertu ziren bitartean (4a. irud.), batez ere NT eta 2Rep zela His-en eraketa partzialki kontrolatzen zutenak iradokitzen zuen. NT2RepCT hidrogela.CT seinalea jatorrizko intentsitatearen % 20ra ere atenuatu zen, CT ere gehienbat hidrogelaren egituran finkatuta dagoela iradokitzen duena.CT-aren zati txikiago baterako, aurreinkubatutako laginean bezain mugikorra dena eta, beraz, soluzio-NMR bidez ikusitakoa, espektroek seinalerik ez dute egituratutako lehen 10 hondakinetarako, ziurrenik His-NT2Rep-en atxikitako zatiaren inmobilizazio zaila dela eta.-NT2RepCT hidrogelen -egoeraren EMN espektroek α-helize eta β-geruzen presentzia nagusia agerian utzi zuten eta, neurri txikiagoan, ausazko bobinaren konformazioa (4b. irudia).NT-n bakarrik dauden metionina-hondakinen aldaketa kimikoen analisiak domeinu hau β-xafla egitura bihurtu zela erakutsi zuen.Disoluzioan NTren denboraren araberako espektroek seinalearen intentsitatearen jaitsiera uniformea ​​erakutsi zuten (4c. irudia), eta NT hidrogelen egoera solidoko RMN-k erakutsi zuen NT hondar gehienak β-xafla egituretara bihurtu zirela (4d. irudia).2Rep-en konformazioa ezin izan da bereizita zehaztu agregatzeko duen joera dela eta.Hala ere, NTCT eta His-NT2RepCT hidrogelen egoera solidoko RMN espektroak oso antzekoak ziren (4b. irudia; 6b. irudi osagarria), 2Rep-ek His-NT2RepCT hidrogelaren egitura-zatian gutxi lagundu zuela iradokitzen du.CT hidrogeletarako, α-helizeak, β-orriak eta ausazko egitura sekundario helikoidalak existitzen zirela aurkitu zen (6d irudi osagarria).Horrek iradokitzen du CTren zati batzuk α-helizeak izaten jarraitzen dutela eta beste batzuk β-orri bihurtzen direla.Beraz, RMN espektroskopiaren emaitzek iradokitzen dute NT garrantzitsua dela hidrogelak eratzeko eta, gainera, β-xafla konformazio batean bihurtzen dela 2Rep eta CTrekin fusioan.Horrekin bat, duela gutxi aurkitu dugu kremailera espazial amiloideak ziurrenik NT domeinuko bost helizeetan sortzen direla, eta Waltz algoritmoak eskualde amiloidogeniko bat iragarri zuen 1. helizean (4e. irudia).
15N-HSQC 10 mg/mL His-NT2RepCT disoluzioaren 2D espektroak (urdina) eta 37 °C-tan inkubazioaren ondoren 19 ordura (gorria).Espektro gorriko gurutze-gailur indibidualak eta espektro urdinean F24, G136, polyA letra bakarreko aminoazidoen sinboloekin eta hondakin-zenbakiekin adierazten dira.Txertatzeek seinalearen intentsitateak denborarekin duen menpekotasuna erakusten du NT, 2Rep eta CT domeinuetako hautatutako hondakinentzat.b His-NT2RepCT hidrogelen egoera solidoko irrati-maiztasunaren (RFDR) espektroak.RFDR espektroetan ikusitako Cα/Cβ hondakinen korrelazioak zehaztu ziren eredu peptidoen aldaketa kimikoekin eta estatistiketatik82,83 eta haien egitura sekundarioetatik eratorritako balioekin alderatuta.SSB - alboko banda birakaria.c 15N-HSQC 10 mg/mL NT disoluzioaren dimentsio bakarreko espektroak 37 °C-tan 36 orduz inkubatzean.Txertaketak intentsitate bolumetrikoa erakusten du denboraren aldean.d NT hidrogelen RFDR egoera solidoko espektroak.RFDR espektroetan ikusitako Cα/Cβ hondakinen eta haien egitura sekundarioen korrelazioak adierazten dira.e Zipper datu-baseko NT45.79 fibrilazio joeraren profilean oinarrituta (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/).Hexapeptidoaren tximista-leiho espazialaren Rosetta energia kcal/mol-etan erakusten da.Barra gorriek fibrosi joera handia duten hexapeptidoak adierazten dituzte (Rosetta energia -23 kcal/mol azpitik; puntu-lerroaren azpian).Barra berdeek atalasearen gainetik Rosetta energia duten zatiak adierazten dituzte eta, beraz, kremailera esterikoa sortzeko aukera gutxiago dute.Prolina duten zatiak analisitik kanpo geratu dira (zutaberik gabe).Karratuek Waltz algoritmoak aurreikusitako amiloidosi-eremuak adierazten dituzte81 (https://waltz.switchlab.org).NTren aminoazido-hondakinen sekuentzia goiko aldean dago, eta β egitura sekundarioan aurkitzen diren hondakin motak (egoera solidoko RMN espektroskopia bidez zehaztuta) gorriz agertzen dira.Bost NT α-helizeen posizioak (H1-H5)28 izendatzen dira.
pH <6,5ean, HT dimerizatu egiten da, beroak edo ureak eragindako desnaturalizazioari erresistentea denez18.NT dimerizazioak eta egonkortasunak gelazioari nola eragiten dioten argitzeko, 100 mg/ml NT duten disoluzioak 8, 7 eta 6 pH-an kontrolatu ziren vial-inbertsio-proba erabiliz.8 eta 7 pH-an inkubatutako NT laginak 30 minutu igaro ondoren 37 °C-tan gelifikatu ziren, baina pH 8 gelak garbi geratu ziren, pH 7 gelak prezipitazio ikusgaia erakusten zuen bitartean (5a. irudia).Aitzitik, HT 6 pH-an zuen disoluzio batek ez zuen gelik eratu, eta hauspeatu handi bat ikus zitekeen 20 min igaro ondoren 37°C-tan.Horrek iradokitzen du dimeroek berek eta/edo monomeroekin alderatuta duten egonkortasun handiagoak gelifikazioa eragozten dutela.Ez zen espero NT 7 eta 6 pH-an prezipitatu bat sortzea, izan ere, jakinarazi baita NT 200 mg/ml27-tan disolbagarria dela, bero desnaturalizazioaren ondoren erraz tolesten dela eta α-helize bat ere mantentzen duela balio baxuagoetan. pH 18. Desadostasun hauen azalpen litekeena da aurretik jakinarazitako esperimentuak giro-tenperaturan edo beherago egin zirela, edo proteina-kontzentrazio nahiko baxuetan16,18,19.
NT ontzien inbertsio-proba (100 mg/mL) pH 8, 7, 6 eta 154 mM NaCl (pH 8) 37 °C-tan inkubatu ondoren.b NT CD espektroak 154 mM NaF eta 154 mM NaCl dituzten eta gabe, hurrenez hurren.222 nm-ko eliptikotasun molarra tolestura naturalen proportzio batean bihurtzen da.c NT inbertsio-saioa (100 mg/mL) NT* (37 °C eta 60 °C), NTA72R (37 °C) eta His-NT-L6 (37 °C eta 60 °C).d NT*, NTA72R eta His-NT-L6 mutanteen CD espektroak.222 nm-ko eliptikotasun molarra tolestura naturalen proportzio batean bihurtzen da.e NTFlSp, NTMiSp eta NTMiSp murriztuaren (100 mg/mL) inbertsio-proba.Eskala barra 5 mm.f NT, NTFlSp, NTMiSp eta NTMiSp murriztuaren CD espektroak.222 nm-ko eliptikotasun molarra tolestura naturalen proportzio batean bihurtzen da.NT espektro osoak 25 °C eta 95 °C-tan erakusten dira 8. irudi osagarrian.
Gatz-kontzentrazio fisiologikoak NT azpiunitateen arteko interakzio elektrostatikoak eta NT transferentziaren dimerizazioa pH18 baxuagora zehazten ditu.154 mM NaCl eta NaF presentziak gelifikazioa inhibitzen zuela, hurrenez hurren (5a, b irudia; 2b irudi osagarria) eta gatz horiek NT monomeroen egonkortasun termikoa areagotu zutela ikusi genuen (5b. irudia, 8. irudi osagarria) .Era berean, egonkortasuna hobetzeak, dimerizazioak baino, gelak sortzea eragozten duela iradokitzen du.
Proteinen dimerizazioak eta gelifikazioan duen egonkortasunaren eginkizuna gehiago aztertzeko, bi mutante erabili ditugu, NT* eta NTA72R, pH 28,30 baxuan monomerikoak ere mantentzen direnak.NT* karga bikoitzeko mutante bat da, zeinetan monomeroaren itxurazko karga dipolarraren banaketa berdindua den, eta horrek dimerizazioa eragozten du eta monomeroen egonkortasuna izugarri handitzen du.NTA72R kargatutako dipolo bat da, baina Arg-ordezkatutako Ala dimeroen mugan kokatzen da, beraz, mutazioek dimerizaziorako beharrezkoak diren azpiunitateen elkarrekintzak oztopatzen dituzte.37 °C-tan inkubatzean, NT*k ez zuen hidrogelik sortu, NTA72R-k, berriz, 15 minutuz gel opako bat osatu zuen (5c. irudia).NT* eta NTA72R biak ezin direnez dimerizatu baina monomeroen egonkortasunean desberdinak direnez (5d. irudia), emaitza hauek oso iradokitzen dute egonkortasun termodinamiko handiak NT gelifikatzea eragozten duela.Horrek ere onartzen du HT*k gel bat eratzen duela tenperatura altuan ezegonkorra denean (8 min igaro ondoren 60 °C-tan; 5c. irudia).Aurretik frogatu da NT-ko metionina-eduki handiak bere toleste naturala likidotzen duela eta sei Met to Leu-ren ordezkoak (hemen His-NT-L6 izenez aipatzen direnak) NT46 monomeroa biziki egonkortzen dutela.NT gelaren eraketarako egitura-malgutasuna beharrezkoa dela suposatuz, His-NT-L6 mutante egonkorra ez zela gelifikatu 37 °C-tan aurkitu genuen (5c, d irudia).Hala ere, His-NT-L6-k gel bat ere eratu zuen 60 min-tan 60°С-tan inkubatzean (5c. irudia).
NTk β xafla egituretan eraldatzeko eta hidrogelak sortzeko duen gaitasuna spidroinaren NT domeinu batzuei baina ez guztiei aplikatzen zaiela dirudi.Zeta mota eta armiarma espezie ezberdinetako NTek, Trichonephila clavipes (NTFlSp), gelak eratu zituzten metionina eduki nahiko baxua eta egonkortasun termiko handia izan arren (5e, f eta 2. taula osagarria irudiak).Aitzitik, Araneus ventricosus-eko (NTMiSp) proteina ampullar txikiko spidroinaren NT-k egonkortasun termiko baxua eta metionina eduki handia ez zuen hidrogelik sortu (2. taula osagarria eta 5e, f irudia).Azken hau molekula barneko lotura disulfuroen presentziarekin lotu daiteke29,47.Koherentziaz, NTMiSp-en disulfuro-loturak murriztu zirenean, hidrogel bat eratu zuen 10 minutuz 37 °C-tan inkubatu ondoren (5e. irudia).Amaitzeko, kontuan izan behar da egitura-malgutasuna irizpide garrantzitsua dela, baina ez bakarra, NTtik gel bat eratzeko.Garrantzitsua izan daitekeen beste faktore bat amiloide fibrilak sortzeko joera da, eta kremaileraren datu-basearekin eta Waltz algoritmoarekin egindako azterketak gelak sortzeko gaitasunaren eta eskualde amiloidogenikoen presentziaren arteko korrelazioa erakutsi zuen, baita aurreikusitako eskualdeen hedadura ere. kremailera esterikoak osatzeko.Korrelazio bat zegoen (2. taula osagarria eta 9. irudi osagarria).
NTren gaitasunak baldintza onetan fibrilak eratzeko eta gelak eratzeko gaitasunak beste proteina zati batzuekin NT fusioek fusio-kideen funtzio osoa duten gelak sor ditzaketela hipotesia egitera eraman gaitu.Hori probatzeko, proteina fluoreszente berdea (GFP) eta purina nukleosido fosforilasa (PNP) sartu ditugu NTren C-muinean, hurrenez hurren.Ondorioz, fusio-proteinak E. coli-n adierazi ziren azken etekin oso altuekin (150 mg/L eta 256 mg/L astindu-matrazaren kulturak His-NT-GFP eta His-NT-PNP-entzat, hurrenez hurren), erakutsitakoarekin bat. NTrekin fusionatutako beste proteinetarako Erref.30. His-NT-GFP (300mg/mL) eta His-NT-PNP (100mg/mL) fusio-proteinek gelak eratu zituzten 2 ordu eta 6,5 ​​ordu 37°C-tan eta, batez ere, GFP frakzioa aldatu gabe geratu zen.Gelifikazioaren ondoren ikusitakoa, hasierako fluoreszentzia-intentsitatearen % 70 gelditzen da gelifikazioaren ondoren (6a. irudia).PNP jarduera neurtzeko his-NT-PNP disoluzio eta geletan, fusio-proteina NTrekin diluitu behar izan dugu, prestaketa puruaren aktibitate entzimatikoa gelifikazio-kontzentrazioetan entseguaren detekzio-eremutik kanpo zegoelako.0,01 mg/mL His-NT-PNP eta 100 mg/mL NT dituen nahasketa batekin eratutako gelak aurrez inkubatutako laginen hasierako jarduera entzimatikoaren % 65 atxiki zuen (6b. irudia).Gela osorik mantendu zen neurketan zehar (10. irudi osagarria).
a Fluoreszentzia-intentsitate erlatiboa His-NT-GFP (300 mg/mL) eta His-NT-GFP hidrogela (300 mg/mL) duen ontzi alderantzikatua gelifikatu aurretik eta UV argiaren azpian.Puntuek banakako neurketak erakusten dituzte (n = 3), errore-barrak desbideratze estandarra erakusten dute.Batez besteko balioa errore-barren erdian erakusten da.b PNP jarduera analisi fluorimetrikoaren bidez lortu da NT (100 mg/ml) eta 0,01 mg/ml his-NT-PNP eta 100 mg/ml Taiwaneko dolar berriak dituen nahasketaz osatutako disoluzioak eta gelak erabiliz.Txertaketak His-NT-PNP (5 mm-ko eskala-barra) duen hidrogel bat duen alderantzikatua erakusten du.
Hemen, NT eta beste spidroin proteina birkonbinatuen hidrogelen sorreraren berri ematen dugu proteina-soluzio bat 37 °C-tan inkubatuz (1. irudia).Gelazioa α-helizeak β-geruza bihurtzearekin eta amiloide-itxurako fibrilak sortzearekin lotuta dagoela erakusten dugu (3 eta 4. irudiak).Aurkikuntza hau harrigarria da, NTak bost helize-sorta globular kiribilduta daudelako, oso disolbagarritasun handiagatik eta egonkortasun handiagatik ezagunak diren >200 mg/mL-ko kontzentrazioetan 4°C-tan hainbat egunetan27.Horrez gain, NTak erraz tolesten dira beroa desnaturalizatu ondoren proteina-kontzentrazio baxuetan µM-tan.Gure emaitzen arabera, fibrilak sortzeak > 10 mg/mL proteina-kontzentrazioa eta tenperatura apur bat altxatzea eskatzen du (1. irudia).Honek bat dator baldintza fisiologikoetan gorabehera termikoen eraginez partzialki zabaldutako egoeran dauden globular tolesturiko proteinetatik amiloide fibrilak sor daitezkeen ideiarekin 48 .Bihurketa hori jasaten duten proteinen adibideak dira intsulina49,50, β2-mikroglobulina, transtiretina eta lisozima51,52,53.NT bere jatorrizko egoeran α-helizea den arren, kate polipeptidikoaren % 65 gutxi gorabehera kremailera esterikoen eraketarekin bateragarria da (4e. irudia) 45 .Monomeroa dinamikoki mugikorra denez46, eskualde amiloidogeniko potentzial hauek tenperatura moderatuan altxatutakoetan eta proteina osoaren kontzentrazio altuetan amiloide fibrilak eratzeko kontzentrazio kritiko batera irits daitezke54.Arrazoibide horri jarraituz, spidroinaren kontzentrazioa eta gelifikazio denboraren arteko korrelazio negatiboa aurkitu dugu (1c. irudia), eta NT konformazio monomerikoa egonkortzen bada mutazioen bidez (NT*, His-NT-L6) edo gatz gehitzearen bidez, saihestu daiteke. eraketa hidrogelak (5. irud.).
Gehienetan, amiloide fibrilak disoluziotik hauspeatu gisa desagertzen dira, baina baldintza jakin batzuetan hidrogelak sor ditzakete55,56,57.Hidrogelak eratzen dituzten fibrilek normalean aspektu-erlazio handia dute eta hiru dimentsioko sare egonkorrak osatzen dituzte korapilatze molekularren bidez,55,58 gure emaitzekin bat.Hidrogelak in vitro sortzeko, proteinak sarritan guztiz edo partzialki zabaltzen dira, adibidez, disolbatzaile organikoen eraginpean, tenperatura altua (70-90 °C) eta/edo pH baxua (1,5-3,0)59,60,61,62.Hemen deskribatutako spidroin hidrogelek ez dute prozesatu gogorra behar, ezta gurutzaketa-agenterik behar hidrogelak egonkortzeko.
Aurretik jakinarazi da spidroinaren errepikapenak eta QD-ek, zetaren irazketan β-xafla aldaketa jasaten dutela diruditenak, hidrogelak sortzen dituztela.Gure aurkikuntzekin alderatuta, inkubazio-denborak eta/edo inkubazio-tenperaturak nabarmen luzeagoak edo handiagoak ziren, hurrenez hurren, eta ondoriozko hidrogelak opakuak izan ohi ziren (7. irudia eta 1. taula osagarria) 37, 38, 63, 64, 65, 66, 67, 68 , 69. Gel-denbora azkarrez gain, NT hidrogelek > 300 mg/mL (% 30) deskribatutako armiarma zetaren proteina-hidrogel birkonbinatzaile guztiak gainditu zituzten, baita hidrogel naturalak ere, hala nola gelatina, alginatoa (% 2), agar (% 0,5). ) eta kolagenoa.(%0,6) (7. irudia eta 1. eta 3. taula osagarriak)37,39,66,67,68,69,70,71,72,73,74.
Ikerketa honetako hidrogelen gel-denbora eta modulu elastikoa spidroinetan oinarritutako beste hidrogel batzuekin eta hautatutako hidrogel naturalekin alderatu dira.Erreferentziak gelifikazio baldintzen deskribapenarekin batera ematen dira.APS Amonio persulfatoa, giro-tenperatura.37, 38, 39, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74.
Badirudi armiarmak biltegiratze garaian spidroina gelifikatzea saihesteko moduak garatu dituztela.Zeta-guruinean proteina-kontzentrazio handia izan arren, domeinu terminalarekin lotutako errepikapen-eskualde handiak esan nahi du guruinaren NT eta CT-ren itxurazko kontzentrazioa 10-20 mg/ml ingurukoa dela, ikerketa honen mugan.beharrezkoa da in vitro ikusitako hidrogelak eratzeko.Gainera, 16 gatzen antzeko kontzentrazioek NT egonkortu zuten, zeta-guruinetan bezala (5b. irudia).NT konformazioa aztertu da E. coli zitosolean eta in vitro aztertutakoan baino estuago tolestuta dagoela ikusi da, gainera, gatza edo beste faktore batzuek in vivo agregazioa eragozten dutela adierazten du.Hala ere, NTak β xafla fibriletan eraldatzeko gaitasuna garrantzitsua izan daiteke filamentuak eratzeko eta etorkizuneko ikerketetan ikertu beharko litzateke.
Ikerketa honetan ikusitako NT-amiloide-itxurako fibrilaren eta hidrogelaren eraketaren alderdi berriez gain, fenomeno honek aplikazio bioteknologiko eta biomedikoak izan ditzakeela ere erakusten dugu (8. irudia).Kontzeptu froga gisa, NT GFP edo PNPrekin konbinatu genuen eta erakutsi genuen fusio proteinak hidrogelak ere sortzen dituela 37 °C-tan inkubatzen denean eta GFP eta PNP frakzioek gelifikazioaren ondoren beren jarduera mantentzen dutela neurri handi batean (6. Irudia).Nukleosido fosforilasak nukleosidoen analogoen sintesi katalizatzaile garrantzitsuak dira75, eta horrek gure aurkikuntza garrantzitsua egiten du industria biofarmazeutikorako.Baldintza onetan hidrogel gardenak eratzen dituzten fusio-proteinak adierazteko kontzeptuak propietate onuragarriak dituzten hidrogel funtzionalizatuak sortzea ahalbidetzen du, hainbat aplikaziotarako, hala nola entzimak immobilizatzeko, kontrolatutako sendagaien askapena eta ehunen ingeniaritza.Horrez gain, NT eta NT* adierazpen-markatzaile eraginkorrak dira30, hau da, NT eta bere aldaerak fusio-proteina disolbagarrien errendimendu handiko ekoizpenerako eta 3D hidrogeletan inmobilizatutako xede-proteinak sortzeko erabil daitezke.
NT disolbagarria, α-helidalduna eta egonkorra da kontzentrazio baxuetan (µM) eta 37 °C-tan.Tenperatura berean, baina gero eta kontzentrazio handiagoan (>10 mg/ml), NTk amiloide antzeko fibrilez osatutako gelak eratzen ditu.NT fusio-proteinek ere fusio-zati guztiz funtzionalekin gel fibrilarak eratzen dituzte, NT erabiliz 3D hidrogeletan hainbat proteina inmobilizatu ahal izateko.Behean: NT (PDB: 4FBS) eta zuntz-sareen eta lotutako proteina-egituren ilustrazioak (suposatuta eta ez eskalan marraztuta, GFP PDB: 2B3Q, 10.2210/pdb2B3Q/pdb; PNP PDB: 4RJ2, 10.2210/pdb4RJ2/pdb).
Eraikuntzak (ikus 4. taula osagarria aminoazidoen sekuentziak barne zerrenda osoa ikusteko) pT7 plasmidoan klonatu eta E. coli BL21 (DE3) bihurtu ziren.Ingeniaritza-plasmidoak dituzten E. coli kanamizinarekin (70 mg/l) osatutako Luria saldan inokulatu eta 30 °C-tan eta 250 rpm-tan hazi ziren gauez.Ondoren, kultura kanamizina zuen LB medioan 1/100 inokulatu zen eta 30 ° C eta 110 rpm-tan hazi zen OD600 0,8ra iritsi arte.NMR ikerketetarako, bakterioak hazi ziren 2 g D-glukosa 13C (Aldrich) eta 1 g amonio kloruro 15N (Cambridge Isotope Laboratories, Inc.) dituen M9 gutxieneko medioan proteina isotopoekin etiketatzeko.Jaitsi tenperatura 20 gradu Celsius-era eta induzitu proteina adierazpena 0,15 mM isopropiltiogalaktopiranosidoarekin (azken kontzentrazioa).Gaueko proteina adierazpenaren ondoren, zelulak 7278 × g-tan bildu ziren, 4 ° C-tan 20 minutuz.Zelula pelletak 20 mM Tris-HCl-an, pH 8-an, berriro esekitzen ziren eta gehiago erabili arte izoztu ziren.Desizoztutako zelulak zelula disruptore bat erabiliz lisatu ziren (TS serieko makinak, Constant Systems Limited, Ingalaterra) 30 kPa-tan.Ondoren, lisadoak 25.000 g-tan zentrifugatu ziren 30 minutuz 4 °C-tan.NTMiSp-erako, pelleta 2 M urean, 20 mM Tris-HCl, pH 8-n, berriro esekitzen zen eta 2 minutuz sonikatu zen (2 s piztu/desaktibatuta, % 65), eta ondoren berriro zentrifugatu zen 25.000 xg-tan, 4° C barruan. 30 min.Gaingatzailea Ni-NTA zutabe batean kargatu zen, 20 mM Tris-HCl, 2 mM imidazolarekin, pH 8rekin garbitu eta, azkenik, proteina 20 mM Tris-HCl, 200 mM imidazolarekin, pH 8rekin eluitu zen. NT2RepCT sortzeko eta NTCT, tronbinaren digestioak His eta NT arteko gunea (ThrCleav) sartzen du.Tronbina zatiketa guneak His-NT-ThrCleav-2Rep-en (2Rep ekoizten du), His-thioredoxin-ThrCleav-NT (NT sortzen du), His-thioredoxin-ThrCleav-CT (CT sortzen du), His-Thioredoxin-ThrCleav-NT-n ere daude. .* (NT* sortzen du), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTA72R (NTA72R sortzen du), His-Thioredoxin-ThrCleav-NTFlSp (NTF1Sp sortzen du) eta His-Sulphur Redoxin-ThrCleav-NTMiSp (NTMiSp sortzen du).Eraikuntzak tronbinarekin digeritu ziren (1:1000) eta gau osoan dializatzen ziren 4°C-tan 20 mM Tris-HCl-arekin, pH 8, Spectra/Por dialisi-mintz bat erabiliz, 6-8 kDa-ko pisu molekularra duen atalasea.Dialisi ondoren, disoluzioa Ni-NTA zutabe batean kargatzen da eta interesa duen proteina duen isuria biltzen da.Proteinen kontzentrazioa 280 nm-ko UV xurgapena neurtuz zehaztu ziren proteina bakoitzaren desagertze-koefizientea erabiliz, NTF1Sp izan ezik, zeinak Bradford saiakuntza erabiltzen zuen fabrikatzailearen protokoloaren arabera.Garbitasuna SDS poliakrilamida (% 4-20) gel elektroforesiaren bidez eta Coomassie urdin distiratsuaren tindaketaz zehaztu zen.Proteinak zentrifuga-iragazkiak erabiliz (VivaSpin 20, GE Healthcare) kontzentratu ziren 4000 xg-tan 10 kDa-ko pisu molekularra moztuta 20 minutuko zikloetan.
Desizoztu proteina-soluzioa eta arretaz pipeta 150 µl 1 ml-ko septum-ontzi argi batean (8 x 40 mm Thermo Scientific).Hodiak parafilmarekin estali eta zigilatu zituzten lurrunketa saihesteko.Laginak (n = 3) 37 °C edo 60 °C-tan inkubatu eta aldian-aldian alderantzikatu dira gelifikazioa ikusteko.Gelifikatzen ez ziren laginak astebetez gutxienez inkubatu ziren.Murriztu NTMiSp disulfuro-loturak 10 mM DTTrekin 10 µM proteina bakoitzeko.Armiarma-zetazko estaldura naturalen gelifikazioa aztertzeko, Suediako zubi-armiarma moztu zen, bi guruin anpulatutako nagusiak pH 8ko 20 mM Tris-HCl tamponaren 200 μl jarri eta moztu egin ziren estaldura guruinetatik bereizteko..Guruinen edukia tamponean disolbatzen da, 50 µl pisu lehorra zehazteko (60 °C-tan irekitako ontzien inkubazioan pisu konstantean) eta 150 µl 37 °C-tan gelifikatzeko.
Neurtzeko geometria/tresna altzairu herdoilgaitzez egina dago, 20 mm-ko goiko diametroa eta 0,5 mm-ko tartea dituen plaka paralelo bat erabiliz.Berotu lagina 25 °C-tik 45 °C-ra eta berriro 25 °C-ra minutuko 1 °C-ko abiaduran, altzairu herdoilgaitzezko beheko Peltier plaka bat erabiliz.Bibrazio-neurketak 0,1 Hz-ko maiztasunarekin eta materialaren eskualde biskoelastiko linealean %5 eta %0,5eko tentsioarekin egin dira 100 mg/mL eta 300-500 mg/mL-ko laginetarako, hurrenez hurren.Erabili hezetasun-ganbera pertsonalizatua lurruntzea saihesteko.Datuak Prism 9 erabiliz aztertu dira.
Infragorriak (IR) espektroak biltzeko giro-tenperaturan 800 eta 3900 cm–1 bitartekoak.ATR gailua, baita espektrometroko argiaren bidea ere, iragazitako aire lehorrez garbitzen da esperimentuaren aurretik eta bitartean.Disoluzioak (500 mg/mL espektroetan ura xurgatzeko gailurrak minimizatzeko) kristalen gainean pipetatu ziren, eta gelak (500 mg/mL) eratu ziren neurketa egin aurretik eta gero kristaletara transferitu (n = 3).1000 eskaneatu grabatu ziren 2 cm-1eko bereizmenarekin eta 2ko zero lan-zikloarekin. Bigarren deribatua OPUS (Bruker) erabiliz kalkulatu zen, bederatzi puntuko leuntze-tartea erabiliz.Espektroak 1720 eta 1580 cm-1 arteko integrazio-eskualde berean normalizatu ziren F. Menges "Spectragryph - Optical Spectroscopy Software" erabiliz.ATR-IR espektroskopian, izpi infragorri baten barneratze-sakonera lagin batean uhin-zenbakien menpekoa da, eta ondorioz, uhin-zenbaki baxuagoetan xurgapen indartsuagoa da uhin-zenbaki altuetan baino.Efektu hauek ez dira zuzendu irudietan ageri diren espektroetarako.3 oso txikiak direlako (4. irudi osagarria).Irudi honetarako zuzendutako espektroak Bruker OPUS softwarearekin kalkulatu dira.
Printzipioz, proteina-konformazioen kuantifikazio integrala posible da osagaien deskonboluzio fidagarriaren ondoren amida I gailurraren barruan.Hala ere, praktikan oztopo batzuk sortzen dira.Espektroko zarata gailur (faltsu) gisa ager daiteke dekonboluzioan zehar.Gainera, ura makurtzearen ondoriozko gailurra bat dator amida I gailurraren posizioarekin eta antzeko magnitudea izan dezake ur-kantitate handia duten laginentzat, hala nola hemen aztertutako gel urtsua.Hori dela eta, ez dugu amida I gailurra guztiz deskonposatzen saiatu, eta gure behaketak beste metodo batzuen laguntzarekin soilik hartu behar dira kontuan, hala nola NMR espektroskopia.
50 mg/ml NT eta His-NT2RepCT-ko disoluzioak gelifikatu ziren gauean 37 °C-tan.Ondoren, hidrogela 20 mM Tris-HCl (pH 8) 12,5 mg/ml-ko kontzentraziora diluitu zen, ondo astindu eta pipeta jarri zen gela apurtzeko.Ondoren, hidrogela 10 aldiz diluitu zen 20 mM Tris-HCl-arekin (pH 8), laginaren 5 μl formvar-ekin estalitako kobre-sare batean aplikatu eta gehiegizko lagina kendu egin zen blotting paperarekin.Laginak bi aldiz garbitu ziren 5 µl MilliQ urarekin eta % 1eko uranil formiatoarekin zikindu ziren 5 minutuz.Kendu gehiegizko orbana paper xurgatzailearekin, gero airez lehortu sarea.Sare horietan irudiak egin dira 100 kV-tan funtzionatzen duen FEI Tecnai 12 Spirit BioTWIN erabiliz.Irudiak x 26.500 eta x 43.000 handitzeetan grabatu ziren Veleta 2k × 2k CCD kamera erabiliz (Olympus Soft Imaging Solutions, GmbH, Münster, Alemania).Lagin bakoitzeko (n = 1), 10-15 irudi grabatu ziren.ImageJ (https://imagej.nih.gov/) irudiak aztertzeko eta zuntz-diametroak neurtzeko erabili zen (n = 100, zuntz desberdinak).Prism 9 parekatu gabeko t-probak (bi buztanak) egiteko erabili zen.His-NT2RepCT eta NT fibrilak batez bestekoak 11,43 (SD 2,035) eta 7,67 (SD 1,389) nm izan ziren, hurrenez hurren.Konfiantza tartea (%95) -4,246tik -3,275era bitartekoa da.askatasun graduak = 198, p < 0,0001.
10 µM tioflabina T (ThT) duten 80 µl lagin likido neurtu ziren hirukoiztuta (n = 3) baldintza estatikoetan Corning hondo beltzeko 96 putzuko hondo garbiko plakak erabiliz (Corning Glass 3881, AEB).Fluoreszentzia-diferentziak 440 nm-ko kitzikapen-iragazkia eta 480 nm-ko igorpen-iragazkia erabiliz erregistratu ziren (BMG Labtech-eko FLUOStar Galaxy, Offenburg, Alemania).ThT seinalea ez zen ez asetu ez itzali, ThT-ren kontzentrazio ezberdinekin esperimentuak egin baitziren seinalearen intentsitatea aldatu gabe.Erregistratu absorbantzia 360 nm-tan lainoa neurtzeko.Ereiteko esperimentuetarako, 100 mg/mL gelak eratu ziren 37°C-tan, berriro esekitzen ziren eta % 5, % 10 eta % 20ko proportzio molaretan hazteko erabili ziren.Datuak Prism 9 erabiliz aztertu dira.
Desizoztu His-NT2RepCT eta NT > 100 mg/mL izotzetan eta iragazi 0,22 µm-ko iragazki batetik.Kontzentrazioak 280 nm-ko xurgapena neurtuz kalkulatu dira Nanodrop erabiliz.Hondo argia duten 96 putzu beltz ez-lokaleko plaka baten putzuetan (Corning), laginak 20 mg/ml diluitu ziren 20 mM Tris-HCl pH 8-n eta 5 μM ThT (azken kontzentrazioa) nahastu ziren, laginaren kontzentrazio osoa. 50 μl bolumena.Laginak 10 minutuz behin 37 °C-tan atera ziren CellObserver (Zeiss) mikroskopio batean transmititutako argi-kanalarekin eta ThT irudietarako FITC kitzikapen eta igorpen-iragazki multzoekin.Irudiak egiteko 20x/0,4 lente bat erabiltzen da.Zen Blue (Zeiss) eta ImageJ (https://imagej.nih.gov/) erabili ziren irudiak aztertzeko.Gelak ere prestatu ziren NT eta His-NT2RepCT soluzioetatik 50 mg/mL-ko kontzentrazioan, 20 mM Tris pH 8 eta 5 µM ThT zuten eta 37 °C-tan inkubatu ziren 90 minutuz.Gel-zatiak 20 mM Tris, pH 8 eta 5 μM ThT zituen putzu berri batera transferitu ziren 96 hondo argi beltz batean.Lortu fluoreszentzia berdea eta eremu distiratsuko irudiak 20x/0,4 handipenean.Irudien analisirako ImageJ erabili da.
Soluzio RMN espektroak 310 K-tan lortu ziren 600 MHz-ko Bruker Avance Neo espektrometro batean QCI Quadrupole Resonance Pulsed Gradient Field Cryoprobe (HFCN) batekin hornituta.13C, 15N markatutako 10 mg/mL proteina homogeneoa duten RMN laginak, 20 mM Tris-HCl (pH 8), % 0,02 (w/v) NaN3, % 5 DO (v/v), (n = 1) .NT2RepCT-ren desplazamendu kimikoak pH 6,7an erabili ziren 15N-HSQC-ren 2D espektroan 23 gailurra esleitzeko.
13C, 15N markatutako hidrogelen angelu magikoa biratzen duten RMN (MAS) espektroak Bruker Avance III HD espektrometroan erregistratu ziren 800 MHz-ko 3,2 mm-ko 13C/15N{1H} elektroirik gabeko zunda batez hornituta.Laginaren tenperatura 277 K-ko tenperatura aldakorreko gas-korronte baten bidez kontrolatu zen. Bi dimentsioko dipolo-erresonantzia-errotazio (DARR)76 eta irrati-maiztasunaren birkonexioa (RFDR)77 espektroak 12,5 kHz eta 20 kHz-ko MAS maiztasunetan eskuratu ziren, hurrenez hurren.Polarizazio gurutzatua (CP) 1H-tik 13C-ra 60,0-tik 48,0 kHz-ko arrapala lineal bat erabiliz egin da 1H-tan, 61,3/71,6 kHz 13C-tan (12,5/20 kHz MAS-tan) eta kontaktu-denbora 0,5-1 ms.Datu bilketan zehar Spinal6478 desakoplamendua 73,5 kHz-an erabili zen.Eskuratzeko denbora 10 milisegundokoa izan zen eta zikloaren atzerapena 2,5 segundokoa izan zen.RFDR espektroetan ikusitako Cα/Cβ lotura bakarreko korrelazioak hondar motako desplazamendu kimiko ezaugarrietan eta DARR espektroetan loturiko korrelazio biderkatuetan oinarrituta esleitu ziren.
Zipper79 datu-basea (https://services.mbi.ucla.edu/zipperdb/) flutter joerak eta Rosetta energia ebaluatzeko erabili zen NT, NTFlSp eta NTMiSp-en.Zipper datu-baseak Rosetta Energy80 kalkulatzen du, eta hainbat energia askeko funtzio konbinatzen ditu proteinen egitura modelatu eta aztertzeko.-23 kcal/mol edo txikiagoa den energia mailak fibrilatzeko joera handia adierazten du.Energia txikiagoak kremaileraren konformazioan bi β-kateen egonkortasun handiagoa esan nahi du.Horrez gain, Waltz algoritmoa NT, NTFlSp eta NTMiSp Erref. eskualde amiloidogenikoak aurreikusteko erabili zen.81. (https://waltz.switchlab.org/).
NT proteinaren disoluzioa 2-(N-morfolino)etanosulfoniko azido (MES) tamponarekin nahastu zen pH 5,5 eta 6,0 pH-a 6 eta 7ra jaisteko, hurrenez hurren.Azken proteina-kontzentrazioa 100 mg/ml izan zen.
Neurketak J-1500 CD espektrometroan (JASCO, AEB) egin ziren 0,1 cm-ko bide optikoa duen 300 μL-ko kubeta erabiliz.Proteinak 10 μM (n = 1) diluitu ziren 20 mM fosfato tamponean (pH 8).Gatzaren presentzian proteinen egonkortasuna aztertzeko, proteinak kontzentrazio berean (n = 1) aztertu ziren 154 mM NaF edo NaCl zituen 20 mM fosfato tamponean (pH 8), hurrenez hurren.Tenperatura azterketak 222 nm-tan erregistratu ziren 25 °C-tik 95 °C-ra 1 °C/min-ko berotze abiadurarekin.Natiboki tolestutako proteinen proportzioa (KDmeasure – KDfinal)/(KDstart – KDfinal) formula erabiliz kalkulatu da.Horrez gain, 260 nm-tik 190 nm-ra arteko bost espektro erregistratu ziren 25 °C-tan eta 95 °C-ra berotu ondoren.Bost espektro batez bestekoa, leundu eta eliptikotasun molar bihurtu ziren.Datuak Prism 9 erabiliz aztertu dira.
His-NT-GFP-ren (300 mg/mL, 80 µL) fluoreszentzia-intentsitatea hirukoiztuta (n = 3) neurtu zen 96 putzuko Corning plaketan hondo garden beltz batekin (Corning Glass 3881, AEB) baldintza estatikoetan.Neurtu laginak 395 nm-ko kitzikapen-uhin-luzera duen fluoreszentzian oinarritutako plaka-irakurgailu batekin eta erregistratu igorpena 509 nm-tan gelifikatu aurretik eta 2 ordu geroago 37 °C-tan.Datuak Prism 9rekin aztertu dira.
Purina nukleosido fosforilasa aktibitate saiakuntza kit (metodo fluorimetrikoa, Sigma Aldrich) fabrikatzailearen argibideen arabera erabili zen.His-NT-PNP duten geletan eta disoluzioetan jarduera neurtzeko, nahastu His-NT-PNP 10 ng 100 mg/mL NTrekin 2 µL-ko bolumen guztira, gelak multzoko detekzio-tartearen gainetik seinalea ematen zuelako.His-NT-PNPrik gabeko gel eta disoluzioen kontrolak sartu ziren.Neurketak bi aldiz egin dira (n = 2).Jarduera neurtu ondoren, erreakzio-nahasketa kendu eta gelari argazkia atera zitzaion, neurketan zehar gela osorik mantentzen zela ziurtatzeko.Datuak Prism 9 erabiliz aztertu dira.
Azterketa-diseinuari buruzko informazio gehiago lortzeko, ikusi artikulu honi lotuta dagoen Nature azterketaren laburpena.
1. eta 2. irudiek hasierako datuak aurkezten dituzte.1c, 2a–c, 3a, b, e–g, 4, 5b, d, f eta 6, irudi osagarriak.3, irudi osagarria.5a, d, irud osagarria.6 eta irud osagarria.8. Datuak Azterketa honetako datuak Zenodo datu-basean daude ostatatuta https://doi.org/10.5281/zenodo.6683653.Ikerketa honetan lortutako EMN datuak BMRBig biltegian argitaratu ziren bmrbig36 sarrera IDarekin.GFP eta PNP egiturak PDBtik hartu dira (GFP 2B3Q, PNP 4RJ2).
Rising, A. eta Johansson, J. Armiarma artifizialaren zeta spinning.Kimika Nazionala.biologia.11, 309–315 (2015).
Babb, PL et al.Nephila clavipes genomak armiarma zetaren geneen aniztasuna eta haien adierazpen konplexua nabarmentzen ditu.Genette Nazionala.49, 895–903 (2017).