347 12,7 * 1,24 mm Altzairu herdoilgaitzezko hodiak, kondentsazio elektrostatiko sinkronoaren eta α-synuclein eta tau koagregazio mekanismo molekularra.

Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.CSS laguntza mugatua duen arakatzailearen bertsioa erabiltzen ari zara.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Horrez gain, etengabeko laguntza bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe erakusten dugu.
Diapositiba bakoitzeko hiru artikulu erakusten dituzten graduatzaileak.Erabili atzeko eta hurrengo botoiak diapositibetan zehar mugitzeko, edo amaierako diapositiba kontroladorearen botoiak diapositiba bakoitzean mugitzeko.

347 altzairu herdoilgaitzezko hodien zehaztapena

347 12,7 * 1,24 mm Altzairu herdoilgaitzezko hodiak

Kanpo Diametroa: 6,00 mm OD-ra 914,4 mm-ko OD, 24"-ra arteko neurriak NB eskuragarri Salgaitik kanpo, OD neurrira Altzairuzko hodiak salgai eskuragarri

SS 347 Hodiaren lodiera-tartea: 0,3 mm - 50 mm, SCH 5, SCH10, SCH 40, SCH 80, SCH 80S, SCH 160, SCH XXS, SCH XS
WT: SCH5S, SCH10S, SCH40S, SCH80S, SCH160S, etab. (0,5-12 mm) Edo tamaina ez-ohikoa behar den moduan egokitu behar da

Mota: SS 347 Joturarik gabeko hodiak |SS 347 ERW Hodiak |SS 347 Hodi Soldatuak |SS 347 fabrikatutako hodiak |SS 347 CDW Hodiak, LSAW Hodiak / Jostura-soldatuak / Berriz marraztuta

Forma: SS 347 hodi biribilak/hodiak, SS 347 hodi karratuak/hodiak, SS 347 hodi angeluzuzenak/hodiak, SS 347 hodi harilkatuak, SS 347 “U” forma, SS 347 zartagineko bobinak, SS 347 hodi hidraulikoak

Luzera: ausazko bakarra, ausazko bikoitza eta nahitaezko luzera. Amaiera: mutur arrunta, mutur alakatua, zapalduta

Amaierako babesa: Plastikozko tapoiak |Kanpoko akabera: 2B, No.4, No.1, No.8 Altzairu herdoilgaitzezko hodien ispilu akabera, akabera bezeroen eskakizunen arabera

Entrega-baldintza: Errezitatua eta Ozpinatutakoa, Leundua, Errekozitua distiratsua, Hotzean Marraztuta

Ikuskapena, Proba Txostenak: Errota Proben Ziurtagiriak, EN 10204 3.1, Txosten kimikoak, Txosten mekanikoak, PMI Proba Txostenak, Ikusizko Ikuskapen Txostenak, Hirugarrenen Ikuskapen Txostenak, NABL-ren Onartutako Laborategi Txostenak, Proba suntsitzaileen Txostenak, Proba ez suntsitzaileak

Enbalatzea: egurrezko kaxetan, plastikozko poltsetan, altzairuzko zerrendatan bilduta edo bezeroen eskaeraren arabera.

Bereziak: goiko neurriak eta zehaztapenak eskatuta fabrikatu daitezke

SS 347 Hodiaren Tamaina Barrutia: 1/2 hazbeteko NB, OD 24 hazbete artekoa

ASTM A312 347: Joturarik gabeko eta jostura zuzeneko hodi austenitiko soldatua tenperatura altuko eta zerbitzu korrosibo orokorrerako pentsatua.Soldaduran ezin da betegarrizko metalik onartzen.

ASTM A358 347: Fusio elektrikoan soldatutako hodi austenitiko korrosiboetarako eta/edo tenperatura altuko zerbitzuetarako.Normalean 8 hazbeteko hodiak baino ez dira ekoizten zehaztapen honetarako.Soldadura bitartean betegarrizko metala gehitzea onartzen da.

ASTM A790 347: Joturarik gabeko eta jostura zuzeneko soldadura ferritiko/austenitikoa (duplexa) zerbitzu korrosibo orokorrerako zuzendua, tentsioko korrosioaren pitzaduraren erresistentziari arreta berezia jarriz.

ASTM A409 347: Jostura zuzena edo espiral-fusio elektrikoa soldatutako diametro handiko horma argi-hodi austenitikoa 14"-tik 30"-ko neurrietan, Sch5S eta Sch 10S hormekin, korrosibo eta/edo altuetarako.

ASTM A376 347: Joturarik gabeko hodi austenitikoa tenperatura altuko aplikazioetarako.

ASTM A813 347: Jostura bakarreko, soldadura bakarreko edo bikoitzeko hodi austenitikoetarako, tenperatura altuko eta aplikazio korrosibo orokorretarako.

ASTM A814 347: Hotz landutako hodi austenitikoa tenperatura altuetarako eta zerbitzu korrosibo orokorrerako.

347H Altzairu herdoilgaitzezko hodiak Konposizio kimikoa

Altzairu herdoilgaitzezko 347H hodiaren propietate mekanikoak

Altzairu herdoilgaitza 347H Hodiak Propietate fisikoak

347H altzairu herdoilgaitzezko hodiaren kalifikazio baliokideak

Amiloide alfa-sinukleina (αS) agregazioa Parkinson gaixotasunaren eta beste sinukleinopatien bereizgarri bat da.Berriki, Alzheimer gaixotasunarekin ohikoa den tau proteina αS patologiarekin lotu da eta αS-an aberatsak diren inklusioetan ko-lokalizatu egiten dela aurkitu da, bi proteinen koagregazio mekanismo molekularra argi ez dagoen arren.Hemen jakinarazten dugu αS fasea kondentsatu likidoetan bereizten dela kondentsazio konplexu elektrostatikoen bidez positiboki kargatutako polipeptidoekin, esate baterako, tau.αS-k polikatioekiko duen afinitatearen eta koagulazio-sarearen balentzia agortzearen tasaren arabera, koaguluak gelifikazio edo koaleszentzia azkarra jasaten dute, eta ondoren, amiloidearen agregazio motela da.Teknika biofisiko aurreratuen multzoa konbinatuz, αS/Tau fase likido-likidoaren bereizketa ezaugarritu eta proteina likidoen kondentsatu batean bi proteinak dituzten agregatu heterogeneoak sortzea eragiten duten funtsezko faktoreak identifikatu ahal izan genituen.
Mintz-konpartimentuez gain, zeluletan bereizketa espaziala kondentsatu biomolekularrak edo tantak izeneko proteina aberatsak eta likido itxurako gorputz trinkoak eratuz ere lor daiteke, fase likido-likidoaren bereizketa (LLPS) deritzon prozesu baten bidez.Tanta horiek elkarrekintza tenporal anitzeko balioen bidez eratzen dira, normalean proteinen edo proteinen eta RNAren artean, eta hainbat funtzio betetzen dituzte ia sistema bizi guztietan.LLPrako gai diren proteina kopuru handi batek konplexutasun baxuko sekuentziak erakusten ditu, naturan oso desordenatuta daudenak eta kondentsatu biomolekularren eraketan3,4,5.Ikerketa esperimental ugarik agerian utzi dute likido-itxurako kondentsatu hauek osatzen dituzten proteinen izaera malgua, sarri desordenatua eta balio anitzekoa, nahiz eta kondentsatu horien hazkuntza eta heltze solidoago batera kontrolatzen duten determinatzaile molekular espezifikoei buruz ezer gutxi ezagutzen den. Estatu..
Datu berriek hipotesia onartzen dute proteina aberranteak bultzatutako LLPS eta tanten eraldaketa egitura solidoetan bide zelular garrantzitsuak izan daitezkeela endekapenezko gaixotasunen bereizgarri diren agregatu toxiko disolbaezinak sortzeko.LLPS-ekin lotutako berez desordenatuta dauden proteina (IDP) asko, askotan oso kargatuak eta malguak, aspalditik egon dira neurodegenerazioarekin lotzen diren amiloideen agregazio-prozesuaren bidez.Bereziki, FUS7 edo TDP-438 bezalako IDP kondentsatu biomolekularrak edo konplexutasun baxuko domeinu handiak dituzten proteinak, hala nola hnRNPA19 bezalako proteinak, gel-itxurako edo are solido forman zahartzen direla frogatu da fluidizazioa izeneko prozesu baten bidez.konposatua.fase solidoaren trantsiziora (LSPT) denboraren funtzioan edo itzulpen-osteko aldaketa edo mutazio patologikoki esanguratsu batzuen aurrean1,7.
In vivo LLPSarekin lotutako beste IDP bat Tau da, mikrotubuluei lotutako proteina desordenatua, zeinaren amiloideen agregazioa Alzheimer gaixotasunean inplikatua izan dena10, baina duela gutxi Parkinson gaixotasunean (PD) eta beste proteinopatia nuklear sinaptiko batzuk erlazionatuta dauden 11, 12, 13.Tau-a disoluziotik/zitoplasmatik berez disoziatzen dela frogatu da interakzio elektrostatiko onen ondorioz14, eta ondorioz, koazerbato elektrostatiko gisa ezagutzen diren tau-aberastutako tantak eratzen dira.Era berean, ikusi da elkarrekintza ez-espezifiko hori naturako kondentsatu biomolekular askoren eragilea dela15.Tau proteinaren kasuan, agregazio elektrostatikoa agregazio sinplearen bidez era daiteke, zeinean proteinaren aurkako kargatutako eskualdeek zatiketa prozesua abiarazten duten, edo agregazio konplexuaren bidez, RNA bezalako karga negatiboko polimeroekin elkarreraginaren bidez.
Duela gutxi, α-sinukleina (αS), PD-n eta sinukleinopatia gisa ezagutzen diren beste gaixotasun neurodegeneratibo batzuetan inplikatutako IDP amiloide bat17,18, frogatu da fluidoen antzeko portaera duten proteina-kondentsatuetan kontzentratutako zelula- eta animalia-ereduetan19,20.In vitro ikerketek frogatu dute αS-k LLPS jasaten duela agregazio soilaren bidez interakzio nagusiki hidrofobikoen bidez, nahiz eta prozesu honek proteina-kontzentrazio oso altuak eta inkubazio denbora atipikoki luzeak behar dituen19,21.In vivo ikusitako αS duten kondentsadoak LLPS prozesu honek edo beste batzuek eratzen diren ala ez, konpondu gabeko arazo nagusia izaten jarraitzen du.Era berean, αS amiloideen agregazioa neuronetan PD-n eta beste sinukleinopatietan ikusi den arren, αS-k zelula barneko amiloide-agregazioa jasaten duen mekanismo zehatza ez dago argi, proteina honen gehiegizko adierazpenak ez baitu berez prozesu hori abiarazten.Kalte zelular gehigarria behar da askotan, zelula barneko αS amiloideen multzoak birnukleatzeko kokapen zelular edo mikroingurune jakin batzuk behar direla iradokitzen duena.Agregaziorako bereziki joera duen ingurune zelular bat proteina kondentsatuen barnealdea izan daiteke 23 .
Interesgarria da αS eta tau Parkinson gaixotasuna eta beste sinukleinopatia batzuk dituzten gizakietan ko-lokalizatu egiten direla αS eta tau 24,25 eta esperimentuek bi proteinen arteko erlazio patologiko sinergiko baten berri eman dute 26,27 αS eta agregazioaren arteko erlazio potentzial bat iradokiz. tau gaixotasun neuroendekapenezkoetan.gaixotasuna.αS eta tau-k elkarreragin eta elkarren agregazioa sustatzen dutela aurkitu da in vitro eta in vivo 28,29 eta bi proteina hauek osatutako agregatu heterogeneoak ikusi dira sinukleinopatiak dituzten pazienteen garunean 30 .Hala ere, ezer gutxi dakigu αS eta tau-ren arteko elkarrekintzaren oinarri molekularrari eta bere ko-agregazioaren mekanismoari buruz.αS-k tau-rekin elkarreragiten duela jakinarazi da αS-ren C-terminal eskualde oso negatiboki kargatutako eskualdearen eta tau-ren erdiko prolina-eskualdearen arteko erakarpen elektrostatiko baten bidez, positiboki kargatutako hondakinetan ere aberastuta dagoena.
Azterketa honetan, αS tantetan disozia daitekeela kondentsazio konplexu elektrostatikoen bidez tau proteinaren presentzian, positiboki kargatutako polipeptidoekin (pLK) bezalako elkarreraginarekin ez bezala, eta prozesu honetan .αS tanta-sarerako aldamio molekula gisa jokatzen du.αS koazerbato elektrostatikoen heltze-prozesuan desberdintasun nabariak identifikatu ditugu, koazerbato-sarean parte hartzen duten proteinen balentzian eta indarraren desberdintasunekin lotzen direnak.Interesgarria da, αS eta tau amiloide proteinen ko-agregazioa ikusi genuen bizi luzeko koazerbato likidoetan eta bi proteina horien ko-agregazioa eragiten duten faktore gako batzuk identifikatu genituen halako koazerbatoetan.Hemen zehatz-mehatz deskribatzen dugu prozesu hau, hau da, gaixotasunaren espezifiko inklusioetan bi proteinen kokalizazioaren azpian dagoen mekanismo molekular posible bat.
αS-k C-terminal buztana oso anionikoa du pH neutroan (1a. irudia), eta LLPSa jasan zezakeela hipotesia egin genuen polipeptido-molekula desordenatu polikationikoekin konplexu elektrostatikoen kondentsazioaren bidez.100 hondar poli-L-lisina (pLK) erabili dugu hasierako molekula eredu gisa positiboki kargatutako eta desordenatutako izaera polimerikoa dela eta 32 pH neutroan. Lehenik eta behin, pLK-k αS-ren Ct domeinuarekin elkarreragin egiten duela baieztatu dugu Soluzio RMN espektroskopia bidez. (1b irudia) 13C/15N markatutako αS erabiliz αS:pLK ratio molar handitzen direnean.pLK-ren interakzioa αS-ren Ct-domeinuarekin desplazamendu kimikoaren perturbazioetan eta proteinaren eskualde honetako gailur intentsitatearen murrizketan agertzen da.Interesgarria da αS pLKrekin nahastu dugunean gutxi gorabehera αS kontzentrazioan.5-25 µM polietilenglikol (% 5-15 PEG-8) aurrean (LLPS buffer tipikoa: 10 mM HEPES pH 7,4, 100 mM NaCl, % 15 PEG-8) berehala igaro ginen proteina eratzeko eremu zabal batetik. .tantak fluoreszentzia (WF) eta eremu distiratsua (BF) mikroskopia erabiliz ikusi ziren (1c. irudia).αS kontzentratua duten 1-5 µm-ko tantatxoak (1 µM AlexaFluor488-rekin etiketatutako αS, AF488-αS gehituta), propietate elektrostatikoak % 10eko 1,6-hexanodiol (1,6-HD) duten erresistentziatik eta duen sentikortasunetik erator daitezke. NaCl kontzentrazioa handitzea (1c. irudia).αS/pLK konplexu elektrostatikoko koazerbatuen fluido-itxurako izaera milisegundotan fusionatzeko duten gaitasunaren arabera frogatzen da (1d. irudia).Turbidimetria erabiliz, baldintza horietan tanten eraketa kuantifikatu genuen, bere egonkortasunarekin lotutako interakzio nagusiaren izaera elektrostatikoa baieztatu genuen (1e. irudia) eta LLPS prozesuan polimero-ratio ezberdinek duten eragina ebaluatu genuen (1f. irudia).Tanta formazioa polimero-erlazio ugaritan ikusten den arren, prozesua oso aldekoa da pLK αS baino handiagoa denean.LLPak ere behatu dira dextrano-70 (70 kDa) desplazamendu-agente kimiko desberdina erabiliz edo hainbat lagin-formatu erabiliz, besteak beste, beira-tantak, hainbat materialetako mikroplaken putzuak, Eppendorf edo kuartzozko kapilarrak.
a Ikerketa honetan erabilitako WT-αS eta ΔCt-αS aldaeretan proteina-eskualde ezberdinen irudikapen eskematikoa.N-terminal domeinu anfipatikoa, amiloide hidrofobikoa (NAC) eta negatiboki kargatutako C-terminal domeinua urdinez, laranjaz eta gorriz agertzen dira, hurrenez hurren.Hondar bakoitzeko karga garbia (NCPR) WT-αS-ren mapa erakusten da.b αS/pLK elkarrekintzaren RMN analisia makromolekula multzorik ezean.pLK kontzentrazioa handitzen den heinean (αS:pLK 1:0,5, 1:1,5 eta 1:10 molar erlazioak berde argian, berdean eta berde ilunean agertzen dira, hurrenez hurren).c Koazerbatu αS/pLK (erlazio molarra 1:10) 25 µM-tan (1 µM AF488 markadun αS edo Atto647N etiketatutako pLK WF irudietarako) LLPS tamponean (goian) edo 500 mM NaCl-arekin (behean ezkerrean) edo 110 ondoren % 1,6-hexanodiol (1,6-HD; behean eskuinean).Eskala barra = 20 µm.d αS/pLK (erlazio molarra 1:10) BF tanta-fusioaren irudi mikroskopiko adierazgarriak 25 μM-ko kontzentrazioan;geziek tanta indibidualak (gezi gorriak eta horiak) tanta berri batean (gezi laranja) batzen direla adierazten dute 200 ms-ko epean).Eskala barra = 20 µm.e Argi-dispertsioa (350 nm-tan) αS/pLK agregazioa LLPS tamponean 500 mM NaCl edo % 10 1,6-HD gehitu aurretik eta ondoren αS 25 µM-tan (N = 3 lagin-erreplika, batez bestekoa eta desbideratze estandarra ere adierazita).f BF irudia (goian) eta argi-dispertsioaren analisia (350 nm-an, behean) αS/pLK agregazioaren 25 μM αS-tan αS:pLK erlazio molar handituz (N = 3 lagin-erreplika, batez bestekoa eta desbideratze estandarra ere adierazita).Eskala barra = 10 µm.Irudi bateko eskala-barrak panel bateko irudi guztien eskala adierazten du.Datu gordinak datu gordinak fitxategi moduan ematen dira.
αS/pLK konplexu elektrostatikoen kondentsazioari buruz eta αS-ren aurreko behaketetan oinarrituta, tau/RNA kondentsatuaren bezero molekula gisa tau31-rekin elkarrekintza zuzenaren bidez, αS eta tau-k disolbatzailearekin batera bereiz zitezkeela hipotesia genuen RNArik ezean. kondentsazioa.konplexu elektrostatikoen bidez, eta αS aldamio-proteina da αS/Tau koazerbatoetan (ikus tau kargaren banaketa 2e irudian).Ikusi genuen 10 μM αS eta 10 μM Tau441 (1 μM AF488-αS eta 1 μM Atto647N-Tau dituztenean, hurrenez hurren) LLPS bufferean nahasten zirela, erraz eratu zirela proteina biak dituzten proteina agregatuak, WF mikroskopiak ikusitako moduan.(2a. irudia).Tanten bi proteinen kokalizazioa (CF) mikroskopia konfokalaren bidez baieztatu zen (1a irudi osagarria).Antzeko portaera ikusi zen dextrano-70 agregazio-agente gisa erabili zenean (1c irudi osagarria).FITC markatutako PEG edo dextranoa erabiliz, bi pilaketa-agenteak laginetan uniformeki banatuta zeudela ikusi genuen, ez bereizketarik ez elkarterik erakusten (1d irudi osagarria).Aitzitik, iradokitzen du sistema honetan faseen bereizketa sustatzen dutela pilaketa-efektu makromolekularren bidez, PEG lehentasunezko jendetza-agente egonkorra baita, beste LLP sistema batzuetan ikusten den bezala33,34.Proteina ugariko tanta hauek NaCl (1 M) sentikorrak ziren, baina ez 1,6-HD (% 10 v/v), haien propietate elektrostatikoak baieztatuz (2a, b irudi osagarria).Haien fluidoen portaera BF mikroskopia erabiliz milisegundoko batuketa-tantaren gertaerak behatuz baieztatu zen (2b. irudia).
a αS/Tau441-ren mikroskopio-irudi konfokalak (CF) koazerbatzen dira LLPS tamponean (proteina bakoitzeko 10 μM, 0,5 μM AF488-rekin markatutako αS eta Atto647N markatutako Tau441).b Interferentzia diferentzialaren kontraste (DIC) irudi adierazgarriak αS/Tau441 tanta-fusio-gertaeren (10 μM proteina bakoitzeko).c Tau441 LLPS-en (0–15 µM) argiaren sakabanatzean (350 nm-tan) oinarritutako fase-diagrama, 50 µM αS-ren ezean (ezkerrean) edo (eskuinean) presentzian.Kolore beroagoek sakabanaketa gehiago adierazten dute.d αS/Tau441 LLPS laginen argi-sakabanaketa αS kontzentrazio handituz (Tau441 5 µM-tan, N = 2-3 lagin errepikapen adierazitako moduan).e Ikerketa honetan erabilitako tau proteinaren aldaera batzuen eta eskualde ezberdinen irudikapen eskematikoa: negatiboki kargatutako N-terminal domeinua (gorria), prolinean aberatsa den eskualdea (urdina), mikrotubulu-lotura domeinua (MTBD, laranjaz nabarmenduta) eta amiloidea osatzen duten bikote espirala.MTBD barruan kokatutako harizpi-eskualdeak (PHF) (grisa).Hondakin bakoitzeko karga garbia (NCPR) Tau441 mapa erakusten da.f 1 µM AF488 markadun αS eta Atto647N markatutako ΔNt- erabiliz, 1 µM AF488 markadun αS edo ΔCt-αS erabiliz ΔNt-Tau (goian, 10 µM proteina bakoitzeko) edo K18 (behean, µM, proteina bakoitzeko). ) ) ) LLPS edo K18 tamponean kondentsatutako WF-ren mikrografiak.Irudi bateko eskala-barrak panel bateko irudi guztien eskala adierazten dute (20 µm a, b eta f paneletarako).c eta d paneletako datu gordinak datu gordina fitxategi gisa ematen dira.
αS-k LLPS prozesu honetan duen eginkizuna probatzeko, lehenik eta behin αS-k tanten egonkortasunean duen eragina ikertu dugu nefelometriaren bidez, NaCl-aren kontzentrazio gero eta handiagoa erabiliz (2c. irudia).αS duten laginetan zenbat eta gatz-kontzentrazio handiagoa izan, orduan eta handiagoak izango dira argi-dispertsioaren balioak (350 nm-tan), eta horrek adierazten du αS-k egonkortzeko eginkizuna LLPS sistema honetan.Antzeko efektua ikus daiteke αS kontzentrazioa (eta, hortaz, αS:Tau441 ratioa) gutxi gorabehera handituz.10 aldiz handitu tau kontzentrazioarekiko (5 µM) (2d. irudia).Koazerbatoetan αS aldamio-proteina bat dela frogatzeko, LLPS-ek eten duen Tau mutantearen portaera ikertzea erabaki dugu, ΔNt-Tau izeneko negatiboki kargatutako N-terminal eskualderik (1-150. hondarrak, ikus 2e. irudia) ez duena.WF mikroskopiak eta nefelometriak baieztatu zuten ΔNt-Tau-k berak ez zuela LLPSrik jasan (2f. irudia eta 2d. irudi osagarria), aurretik jakinarazi zuen bezala 14. Hala ere, αS Tau moztutako aldaera honen dispertsio-soluzioei gehitu zitzaienean, LLPS prozesua guztiz izan zen. Tau-ren eta αS-ren tamaina osoko soluzioen tanta-dentsitatetik hurbil dagoen tanta-dentsitatearekin eta proteina-kontzentrazio antzekoetan.Prozesu hau pilaketa makromolekular baxuko baldintzetan ere ikus daiteke (2c irudi osagarria).C-terminaleko αS eskualdearen eginkizuna, baina ez bere luzera osoa, LLPS prozesuan tantaren eraketaren inhibizioaren bidez frogatu zen (ΔCt-) 104-140 (Irudia 1a) hondakinak ez dituen C-terminal moztutako αS aldaera bat erabiliz. αS) proteina (2f irudia eta 2d irudi osagarria).αS eta ΔNt-Tau-ren kokalizazioa fluoreszentzia-mikroskopia konfokalaren bidez baieztatu zen (1b irudi osagarria).
Tau441 eta αS arteko LLPS mekanismoa gehiago probatzeko, Tau aldaera gehigarri bat erabili zen, hots, mikrotubulu-lotura-domeinuko (PHF) parekatua den harizpi helikoidalaren nukleoaren zatia (MTBD), zeinak lau errepikapen-domeinu ezaugarri baditu, normalean ere ezagunak. K18 zati gisa (ikus 2e. irudia).Duela gutxi jakinarazi da αS lehentasunez lotzen dela prolinean aberatsa den domeinu batean kokatuta dagoen tau proteinarekin, mikrotubuluekin lotzeko domeinuaren aurreko sekuentzia batean.Hala ere, PHF eskualdea positiboki kargatutako hondakinetan ere aberatsa da (ikus 2e irudia), batez ere lisina (% 15eko hondarrak), eta horrek eskualde honek αS/Tau konplexuaren kondentsazioan ere laguntzen duen probatzera bultzatu gaitu.Ikusi genuen K18-k bakarrik ezin zuela LLPS piztu 100 μM-ko kontzentrazioetan probatutako baldintzetan (LLPS buffer % 15 PEG edo % 20 dextranoarekin) (2f irudia).Hala ere, 50 µM αS eta 50 µM K18-ra gehitu genituenean, K18 eta αS zuten proteina-tanten eraketa azkarra ikusi zen nefelometria (2d irudi osagarria) eta WF mikroskopia bidez (2f irudia).Espero zen bezala, ΔCt-αS-k ezin izan zuen K18ren LLPS portaera berreskuratu (2f. irudia).Kontuan izan dugu αS/K18 agregazioak proteina-kontzentrazio apur bat handiagoak behar dituela LLPS eragiteko αS/ΔNt-Tau edo αS/Tau441-ekin alderatuta, beste gauza batzuk berdinak izanik.Hori koherentea da αS C-terminal eskualdeak prolinean aberatsa den Tau domeinuarekin mikrotubulu-lotura domeinuarekin alderatuta, aurrez deskribatu bezala 31 .
ΔNt-Tau-k αS-rik ezean LLPS-a egin ezin duela kontuan hartuta, Tau aldaera hau aukeratu dugu αS/Tau LLPS karakterizatzeko eredu gisa, Tau luzera duten LLPS sistemetan duen sinpletasuna (isotipoa, Tau441/Tau441) kontuan hartuta.agregazio-prozesu konplexuekin (heterotipikoa, αS/Tau441).αS/Tau eta αS/ΔNt-Tau sistemetan αS agregazio-maila (fase kondentsatutako proteinaren zati gisa, fαS,c) zentrifugazioaren eta fase sakabanatuaren SDS-PAGE analisiaren bidez (ikus 2e), oso antzeko balioak aurkitu ditugu. proteina guztientzat kontzentrazio berean.Bereziki, fαS,c 84 ± 2% eta 79 ± 7% αS/Tau eta αS/ΔNt-Tau-rentzat, hurrenez hurren, αS eta tau-ren arteko elkarrekintza heterotipikoa tau molekulen arteko elkarrekintza baino handiagoa dela iradokitzen du.artean.
Hainbat polikazioekiko elkarreragina eta kondentsazio-prozesuaren eragina αS zinetikan ikertu ziren lehenengoz fotobleaching ondoren (FRAP) fluoreszentzia berreskuratzeko metodoaren bidez.αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau eta αS/pLK koazerbatuak probatu ditugu (100 μM αS 2 μM αS AF488-αS eta 100 μM Tau441 edo ΔNt-Tau edo 1 mM pLKrekin osatuta).Datuak laginaren osagaiak nahastu eta lehen 30 minutuetan lortu ziren.FRAP irudi adierazgarrietatik (3a. irudia, αS/Tau441 kondentsazioa) eta haiei dagozkien denbora-kurbetatik (3b. irudia, 3. irudi osagarria), ikus daiteke αS zinetika Tau441 koazerbatoen oso antzekoa dela.eta ΔNt-Tau, pLK-rekin askoz azkarragoa dena.Koazerbatuaren barneko αS-ren difusio-koefizienteak FRAP-en arabera (Kang et al. 35-ek deskribatu bezala) D = 0,013 ± 0,009 µm2/s eta D = 0,026 ± 0,008 µm2/s αS/Tau441 eta αNt-S/Δ-rako dira. αS/ sistema.pLK, Tau eta D = 0,18 ± 0,04 µm2/s, hurrenez hurren (3c. irudia).Hala ere, fase sakabanatuan αS difusio-koefizientea fase kondentsatu guztiak baino hainbat magnitude-ordena handiagoa da, Fluoreszentzia Korrelazio Espektroskopiak (FCS, ikus 3. irudi osagarria) baldintza berdinetan (LLPS buffer) baina polikatiorik ezean zehaztutakoaren arabera. (D = 8 ± 4 µm2/s).Hori dela eta, αS itzulpenaren zinetika nabarmen murrizten da koazerbatoetan barreiatutako faseko proteinen aldean pilaketa molekular efektu nabarmenen ondorioz, nahiz eta koazerbato guztiek likido-itxurako propietateak mantentzen dituzten eratu ondorengo lehen ordu erdian, tau fasearen aldean.pLK kondentsatuan zinetika azkarragoa.
a–c FRAP analisia αS dinamikaren (% 2 AF488 markatutako αS) koazerbato elektrostatikoetan.αS/Tau441 FRAP entseguen irudi adierazgarriak hirukoiztuta agertzen dira (a), non zirkulu gorriak dekolorizatutako eremuak adierazten dituen.Eskala-barra 5 µm-koa da.b Batez besteko FRAP kurbak eta (c) kalkulatutako difusio-koefizienteak (D) hiru esperimentutako 5-6 (N) tanta desberdinetarako 100 µM αS eta Tau441 (gorria) edo ΔNt-Tau (urdina) edo pLK (berdea) kontzentrazio equimolarrak erabiliz. LLPSren kontzentrazioa hamar aldiz.FRAP kurbaren desbideratze estandarra itzal kolorez erakusten da.Konparazio baterako, fase sakabanatuan αS difusio-koefizientea hirukoiztuta zehaztu zen fluoreszentzia korrelazio espektroskopia (FCS) erabiliz (ikus 3. irudi osagarria eta metodoak informazio gehiago lortzeko).d 100 μM TEMPOL-122-αS-ko X bandako EPR espektro jarraituak LLPS bufferean inolako polikaziorik gabe (beltza) edo 100 μM Tau441 (gorria) edo ΔNt-Tau (urdina) edo 1 mM pLK (berdea) aurrean.Txertaketak aldaketa nabarmenenak gertatzen diren eremu-lerro sendoen ikuspegi handitua erakusten du.e 50 μM TEMPOL-122-αS-ko lotura-kurbak hainbat polikaziorekin LLPSrik ezean (PEGrik gabe).EPR espektro normalizatuaren II (IIII/III) bandaren anplitude murriztuak Tau441 (gorria), ΔNt-Tau (urdina) eta pLK (berdea) ratio molarrak areagotzen dituela erakusten da.Koloretako lerroek datuetara egokitzea erakusten dute kurba bakoitzean n lotura-gune berdinak eta independente dituen lotze-eredu zakar baten bidez.Datu gordinak datu gordinak fitxategi moduan ematen dira.
Osagarri gisa, αS-ren dinamika ikertu dugu hainbat koazerbatotan, zuzendutako spin etiketatzea (SDSL) eta elektroi erresonantzia paramagnetiko jarraitua (CW-EPR) erabiliz.Metodo hau oso erabilgarria dela frogatu da IDPren malgutasuna eta dinamikaren berri emateko hondar bereizmen errealista batekin36,37,38.Horretarako, Cys mutante bakarreko zisteina-hondarrak eraiki ditugu eta 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-oxyl (TEMPOL) spin zunda erabili dugu.Maleimida deribatuek etiketatzen dituzte.Zehatzago esanda, TEMPOL zundak txertatu ditugu 122 edo 24 αS posizioan (TEMPOL-122-αS eta TEMPOL-24-αS).Lehenengo kasuan, proteinaren C-terminalaren eskualdea dugu helburu, polikatioekin elkarrekintzan parte hartzen duena.Horren ordez, 24. posizioak kondentsatutako proteinen dinamika orokorrari buruzko informazioa eman diezaguke.Bi kasuetan, sakabanatutako faseko proteinen lortutako EPR seinaleak mugimendu azkarrean dauden nitroxido erradikalei dagozkie.Fase bereizi ondoren tau edo pLK (100 μM TEMPOL-αS, Tau441 edo ΔNt-Tau 1:1 edo pLK 1:10 proportzioan) presentzian, intentsitate gailur erlatiboaren igoera ikusi zen. αS-ren EPR espektroa.Galera-lerroa zabaldu egin zen, αS berrorientazio zinetika murriztua adieraziz tantetan diluitutako proteinarekin alderatuta (3d irudia, 4a irudi osagarria).Aldaketa hauek nabarmenagoak dira 122. posizioan. 24. posizioan pLK-ren presentziak zundaren zinetikari eragin ez zion bitartean, 122. posizioan lerro espektralaren forma nabarmen aldatu zen (4a irudi osagarria).Bi αS/polikazio sistemen 122 posizioan espektroak modelatzen saiatu ginenean, Spin-etiketatutako IDP38,39 dinamika deskribatzeko erabili ohi den eredu isotropoa erabiliz (5a irudi osagarria), ezin izan genituen espektro esperimentalak berreraiki..24 spin-kontrasteen posizioaren simulazio espektrala (5a irudi osagarria).Honek iradokitzen du αS-ren C-terminal eskualdeko spin-konfigurazioen espazioan lehentasunezko posizioak daudela polikazioen presentzian.EPR baldintza esperimentaletan fase kondentsatuan αS-aren frakzioa kontuan hartuta (% 84 ± 2, % 79 ± 7 eta % 47 ± 4 αS/Tau441, αS/ΔNt-Tau eta αS/pLK, hurrenez hurren, ikusi Osagarria). c), datuen analisiaren 2e irudia, ikus daiteke EPR metodoak detektatu duen zabaltzeak αS-ren C-terminal eskualdearen elkarrekintza islatzen duela kondentsatutako fasean hainbat polikaziorekin (aldaketa nagusia TEMPOL-122- erabiltzean. αS), eta ez proteina-kondentsazioa.Zundan mikrobiskositatearen igoera ikusten da.Espero zen bezala, proteinaren EPR espektroa LLPS ez den beste baldintzetan guztiz berreskuratu zen 1 M NaCl nahasteari gehitu zitzaionean (4b irudi osagarria).Orokorrean, gure datuek iradokitzen dute CW-EPR-k detektatutako aldaketek batez ere αS-ren C-terminal eskualdearen elkarrekintza islatzen dutela fase kondentsatuan hainbat polikaziorekin, eta elkarrekintza hau pLK-rekin Taurekin baino indartsuagoa dela dirudi.
Koazerbatuan dauden proteinei buruzko informazio estruktural gehiago lortzeko, LLPS sistema disoluzioan RMN erabiliz aztertzea erabaki dugu.Hala ere, fase sakabanatuan geratzen den αS frakzioa bakarrik detektatu ahal izan dugu, koazerbatuaren barneko proteina dinamika murriztua eta disoluzioaren behealdean fase trinko bat izan daiteke RMN analisian.LLPS laginaren fase sakabanatuan geratzen den proteinaren egitura eta dinamika NMR erabiliz (5c, d irudi osagarria) erabiliz, proteinak pLK eta ΔNt-Tau-ren presentzian ia berdin jokatzen zuela ohartu ginen, biak. proteina bizkarrezurreko egitura eta dinamika sekundarioan zeudenak, bigarren mailako aldaketa kimikoari eta R1ρ erlaxazioari buruzko esperimentuek agerian utzi zuten.RMN-ren datuek erakusten dute αS-ren C-muturrak malgutasun konformazionalaren galera nabarmena jasaten duela bere izaera desordenatua mantentzen duen bitartean, gainerako proteina-sekuentzia bezala, polikazioekin dituen elkarrekintzak direla eta.
TEMPOL-122-αS fase kondentsatuan ikusitako CW-EPR seinalearen zabaltzeak proteinak polikatioekin duen interakzioa islatzen duenez, EPR titulazio bat egin genuen αS-ek hainbat polikatiorekin duen lotura-afintasuna ebaluatzeko LLPSrik ezean (no metaketarik ez). Buffer LLPS), elkarrekintzak berdinak direla fase diluituetan eta kontzentratuetan (gure datuek baieztatzen dute, 4a irudi osagarria eta 6 irudi osagarria).Helburua koazerbato guztiek, fluidoen antzeko propietate komunak izan arren, maila molekularrean azpiko portaera diferentzialren bat erakusten duten ikustea zen.Espero zen bezala, EPR espektroa polikazio-kontzentrazioa handituz hedatu zen, malgutasun molekularra murriztea islatuz elkarrekintza-kide guztien interakzio molekularrengatik ia saturatzeraino (3e. irudia, 6. irudi osagarria).pLK-k saturazio hau ratio molar baxuago batean lortu zuen (polikazioa:αS) ΔNt-Tau eta Tau441-ekin alderatuta.Izan ere, datuak gutxi gorabeherako lotura-eredu batekin n lotura-gune berdinak eta independenteak suposatuz gero, pLK-ren (~ 5 μM) itxurazko disoziazio-konstantea Tau441 edo ΔNt-Tau (~ 50 μM) baino magnitude ordena txikiagoa dela erakutsi zuen. ).µM).Hau gutxi gorabeherako estimazioa den arren, horrek iradokitzen du αS-k afinitate handiagoa duela karga positibo-eskualde jarraitua duten polikazio sinpleagoekiko.αS eta hainbat polikazioren arteko afinitate-diferentzia hori kontuan hartuta, haien likido-propietateak denboran zehar desberdin alda daitezkeela eta, beraz, LSPT prozesu desberdinak pairatu ditzaketela hipotesia genuen.
Proteinaren koazerbatuaren barneko ingurune oso jendetsua eta proteinaren amiloide izaera kontuan hartuta, denboran zehar koazerbatuaren portaera ikusi genuen LSPT prozesu posibleak detektatzeko.BF eta CF mikroskopia erabiliz (4. Irudia), ikusi dugu αS/Tau441 neurri handi batean koazerbatzen dela disoluzioan, putzuaren/labainaren behealdean gainazala ukitzen eta bustitzen duten tanta handiak sortzen direla, espero bezala (irudi osagarria). 7d);behean osatutako egitura horiei “protein balts” deitzen diegu.Egitura hauek fluidoak izaten jarraitzen zuten fusionatzeko gaitasunari eusten baitzuten (7b irudi osagarria) eta LLPS abiarazi ondoren hainbat orduz ikusi ahal izan ziren (4. irudia eta 7c. irudi osagarria).Hezetze-prozesua material hidrofoboen eta ez hidrofoboen gainazalean hobetzen dela ikusi dugu (7a irudi osagarria), karga desorekatuekin eta, beraz, gainazal potentzial elektrostatiko altuak dituzten koazerbato elektrostatikoentzat espero den bezala.Nabarmentzekoa, αS/ΔNt-Tau koaleszentzia eta rafting-a nabarmen murriztu ziren, αS/pLK kondentsatuak nabarmen murriztu ziren bitartean (4. irudia).Inkubazio-denbora laburrean, αS/pLK tantak gainazal hidrofiloa batu eta bustitzeko gai izan ziren, baina prozesu hau azkar gelditu zen eta 5 ordu inkubazioaren ondoren, koaleszentzia-gertakari mugatuak baino ez ziren ikusi eta ez zen bustidurarik ikusi.– Gel-tantaka trantsizioa.
100 µM αS (% 1 etiketa fluoreszentea) duten 100 µM αS (% 1 etiketa fluoreszentea) duten BF (gris-eskala panelak) eta CF (eskuineko panelak, AF488 markatutako αS berdez) 100 µM Tau441 (goian) fluoreszentzia ΔN irudi mikroskopikoen aurrean -Tau (erdian) edo 1 mM pLK (behean) inkubazio-denbora eta foku altuera desberdinetan (z, plakaren hondotik putzutik distantzia).Esperimentuak 4-6 aldiz errepikatu ziren bata bestearengandik independenteki, emaitza berdinekin.αS/Tau441 koazerbatoak 24 orduren buruan bustitzen dira, irudia baino baltsa handiagoak eratuz.Irudi guztien eskala-barra 20 µm-koa da.
Ondoren, αS/Tau441 LLPSn eratutako fluido-itxurako proteina-igerileku handiek aztertutako proteinaren baten amiloideen agregazioa ekarriko ote zuten galdetu genuen.αS/Tau441 tanten heltzea denboran zehar jarraitu genuen WF mikroskopiarekin goiko baldintza berdinetan, baina 1 μM AF488-rekin etiketatutako αS eta Atto647N markatutako Tau441 erabiliz (5a. irudia).Espero bezala, heltze-prozesu osoan zehar proteinaren lokalizazio osoa ikusi dugu.Interesgarria da ca.5 orduren buruan, almadien barruan egitura ez-zirkularragoak ikusi ziren, guk “puntu” deitzen genituzkeenak, horietako batzuk αS-rekin kolokanizatuta zeuden, eta beste batzuk Tau441-en aberastu ziren (5a. irudia, gezi zuriak).Leku hauek beti ikusi izan dira baltsa barruan neurri handiagoan αS/ΔNt-Tau-rentzat αS/ΔNt-Tau-rentzat baino.Ez zegoen fusio/bustitzeko gaitasunik gabeko pLK eta Tau sistemen tantetan puntu bereizirik.αS eta Tau441 duten orban hauek amiloide antzeko agregatuak diren ala ez probatzeko, antzeko esperimentu bat egin dugu CF mikroskopia erabiliz, non Tau441 Atto647N-rekin etiketatu eta 12,5 μM amiloide espezifikoko tioflabina-T (ThT) gehitu zen hasieratik.tindagai.Nahiz eta αS/Tau441 tanten edo baltsen ThT tindaketa ikusi ez zen 24 orduko inkubazioaren ondoren ere (5b. irudia, goiko errenkada - proteina baltsen gainean geratzen ziren tantak), baltsa barruan Atto647N-Tau441 zuten ThT-positiboak oso ahulak ziren.honek aurretiaz deskribatutako orbanen tamaina, forma eta kokapena errepikatzen du (5b. irudia, erdiko eta beheko errenkadak), iradokitzen baitu orbanak zahartzen diren fluido koazerbatoetan eratutako amiloide-itxurako agregatuei dagozkiela.
WF 25 μM αS inkubazio-denbora eta foku-altuera desberdinetan (z, lotu gabeko hondotik distantzia) 25 μM Tau441 (1 μM AF488-rekin etiketatuta αS eta Atto647N markatutako Tau441) mikroskopio-plaka baten putzu batean LLPS bufferarekin) .Sei esperimentu modu independentean errepikatu ziren antzeko emaitzekin.b CF irudi mikroskopikoa 25 μM αS 25 μM Tau441 (1 μM Atto647N markatutako Tau441) eta 12,5 μM tioflabina-T (ThT) aurrean.Proteina-tanta haztatuak eta metatutako proteina-almadiak eta lekuak goiko eta erdiko errenkadetan erakusten dira, hurrenez hurren.Beheko errenkadak 3 erreplika independenteren baltsa eta tanten irudiak erakusten ditu.Gezi zuriek ThT positiboak diren puntuak adierazten dituzte bi paneletan.Irudi guztien eskala-barra 20 µm-koa da.
Likidotik solidorako trantsizioan zehar koazerbatoen proteina sarean izandako aldaketak zehatzago aztertzeko, fluoreszentzia-bizitzarako irudia (FLIM) eta Förster erresonantzia-energia transferitzeko mikroskopia (FRET) erabili ditugu (6. Irudia eta 8. eta 9. Irudi osagarriak).Hipotesi genuen geruzaren heltze koazerbatuak proteina-egitura kondentsatuago edo solidoago batean bateratuta egoteak proteinaren eta hari atxikitako zunda fluoreszentearen arteko kontaktu estuagoa dakarrela, eta potentzialki zundaren bizitza laburtu batean ageri den itzaltze-efektua sortuz (τ) , aurretik azaldu bezala40.,41 ,42.Horrez gain, etiketa bikoitzeko laginetarako (AF488 eta Atto647N FRET emaile eta koloratzaile onartzaile gisa, hurrenez hurren), τ-en beherakada hau koazerbatuaren kondentsazioarekin eta FRET(E) eraginkortasunaren handitzearekin batera izan daiteke LSPT-n zehar.LLPS αS/Tau441 eta αS/ΔNt-Tau laginetan (proteina bakoitzaren 25 µM LLPS bufferan 1 µM AF488 markatutako αS eta/edo Atto647N etiketatutako Tau441 edo ΔNt-Tau markatutako 1 µM daukan denboran zehar kontrolatu dugu).Joera orokor bat ikusi genuen AF488 (τ488) eta Atto647N (τ647N) zunden fluoreszentziaren iraupena apur bat gutxitu zela koazerbatoak heldu ahala (6. irudia eta 8c. irudi osagarria).Interesgarria da aldaketa hori nabarmen hobetu zen baltsa barruko puntuetan (6c. irudia), puntuetan proteina kondentsazio gehiago gertatu zela adieraziz.Horren alde, ez zen fluoreszentziaren iraupenaren aldaketa nabarmenik ikusi 24 orduko αS/ΔNt-Tau tantetan (8d. irudi osagarria), iradokitzen du tanten gelifikazioa spottingetik bereizten den prozesu bat dela eta hori ez dagoela berrantolaketa molekular esanguratsuarekin batera. koazerbatuen barruan.Kontuan izan behar da puntuek tamaina eta eduki aldakorra dutela αSn, batez ere αS/Tau441 sistemarako (8e irudi osagarria).Spoko fluoreszentziaren iraupenaren murrizketa intentsitatea handitzearekin batera izan zen, batez ere Atto647N etiketatutako Tau441 (8a irudi osagarria), eta FRET eraginkortasun handiagoak bai αS/Tau441 bai αS/ΔNt-Tau sistemetarako, LLPS bost orduetan kondentsazio gehiago adieraziz. piztu ondoren, elektrizitate estatikoko proteinak kondentsatu egin ziren.αS/ΔNt-Tau-rekin alderatuta, τ647N baxuagoak eta τ488 zertxobait handiagoak ikusi genituen αS/Tau441 lekuetan, FRET balio baxuago eta ez homogeneoagoekin batera.Baliteke hori αS/Tau441 sisteman, agregatuetan ikusitako eta espero den αS ugaritasuna heterogeneoagoa dela, askotan subestekiometrikoa Tau-rekin alderatuta, Tau441-ek berak LLPS eta agregazioa ere jasan dezakeelako (8e irudi osagarria) .Hala ere, tanten koaleszentzia, baltsa eraketa eta, batez ere, proteina-agregazio-maila likido-antzeko koazerbatoen barnean maximoa da Tau441 eta αS daudenean.
a αS/Tau441 eta αS/ΔNt-Tau-ren Bizitza osorako fluoreszentzia-mikroskopiako irudiak proteina bakoitzaren 25 μM-tan (1 μM AF488 markatutako αS eta 1 μM Atto647N markatutako Tau441 edo ΔNt-Tau-tau-tau) in.Zutabeek LLPS laginen irudi adierazgarriak erakusten dituzte heltze-denbora desberdinetan (30 min, 5 h eta 24 h).Marko gorriak αS/Tau441 puntuak dituen eskualdea erakusten du.Bizi-iraupenak kolore-barra gisa erakusten dira.Eskala-barra = 20 µm irudi guztientzat.b Hautatutako eremuaren FLIM irudia handitua, a paneleko koadro gorrian agertzen dena.Bizi-tarteak a paneleko kolore-eskala bera erabiliz erakusten dira.Eskala barra = 5 µm.c AF488 (αS-ri erantsita) edo Atto647N (Tau-ri lotuta) erakusten duten histogramak proteina-espezie desberdinetarako (tantak-D-, baltsa-R- eta speckle-P) αS-rako grabatutako FLIM irudietan identifikatutako denbora-banaketa Tau441 eta bizi-iraupena. αS/ΔNt-Tau koazervato laginak (N = 17-32 ROI D-rako, 29-44 ROI R-rako eta 21-51 ROI puntuetarako).Batez besteko eta mediana balioak karratu horiak eta marra beltz gisa erakusten dira koadroen barruan, hurrenez hurren.Koadroaren beheko eta goiko mugek lehen eta hirugarren kuartilak adierazten dituzte, hurrenez hurren, eta 1,5 bider arteko kuartilaren barruko balio minimoak eta maximoak (IQR) bibote gisa erakusten dira.Outlierak diamante beltz gisa erakusten dira.Banaketa bikoteen arteko esanahi estatistikoa bi laginetako t-test baten bidez zehaztu zen, bariantza desorekatuak hartuz.Bi isatseko t-testaren p balioak izartxoekin erakusten dira alderatutako datu pare bakoitzeko (* p-balioa > 0,01, ** p-balioa > 0,001, *** p-balioa > 0,0001, **** p-balioa > 0,00001), ns Arduragabetasuna adierazten du (p-balioa > 0,05).p balio zehatzak 1. taula osagarrian ematen dira, eta jatorrizko datuak datu gordinaren fitxategi gisa aurkezten dira.
Puntu/agregatuen amiloide-itxurako izaera gehiago frogatzeko, 24 orduz zikindu gabeko koazerbato-laginak tratatu genituen (1 M) NaCl-ren kontzentrazio handiekin, eta horrek proteina koazerbatoetatik agregatuak bereiztea eragin zuen.Agregazio isolatuak (hau da, agregakinen disoluzio sakabanatua) indar atomikoaren mikroskopia (AFM) erabiliz ikusi zirenean, 15 nm inguruko altuera erregularra duen morfologia nagusiki esferikoa ikusi genuen, gatz kontzentrazio handiko baldintzetan elkartu ohi dena, antzekoa. fibril amiloide tipikoen portaera gainazaleko efektu hidrofobiko indartsuaren ondorioz (kontuan izan fibrilek normalean ~ 10 nm-ko altuera dutela) (10a irudi osagarria).Interesgarria da, ThT-ren fluoreszentzia-saio estandar batean agregatu isolatuak ThT-rekin inkubatu zirenean, ThT fluoreszentzia-errendimendu kuantikoaren gorakada izugarria ikusi genuen, koloratzailea αS amiloide fibril tipikoekin inkubatu zenean ikusitakoaren parekoa (10b irudi osagarria), iradokiz. Agregatu koazerbatuek amiloide antzeko egiturak dituzte..Izan ere, agregatuak gatz-kontzentrazio handiekiko toleranteak ziren baina 4 M guanidina kloruroarekiko (GdnHCl) sentikorrak ziren, amiloide fibril tipikoak bezala (10c irudi osagarria).
Ondoren, agregatuen konposizioa molekula bakarreko fluoreszentzia, fluoreszentzia korrelazio/korrelazio gurutzatuaren espektroskopia espezifikoa (FCS/FCCS) eta bi koloreko kointzidentzia detektatzeko leherketa-analisia (TCCD) erabiliz aztertu dugu.Horretarako, αS eta Tau441 (biak 25 μM) dituzten 100 μl LLPS laginetan 24 orduko inkubazioaren ondoren eratutako agregatuak isolatu genituen 1 μM AF488 markatutako αS eta 1 μM Atto647N markatutako Tau441ekin batera.Diluitu lortutako disoluzio agregatu sakabanatua egoera monomolekularra, PEGrik gabeko buffer bera eta 1 M NaCl erabiliz (agregatuak koazerbatotik bereizteko erabiltzen den buffer bera) LLPS eta proteinen arteko interakzio elektrostatiko posibleak saihesteko.Molekula bakar baten denbora-ibilbidearen adibide bat 7a irudian ikus daiteke.FCCS/FCS analisiak (korrelazio gurutzatua, CC eta autokorrelazioa, AC) erakutsi zuen αS eta tau zuten agregatuak ugariak zirela laginetan (ikus CC kurba 7b. irudian, ezkerreko panelean), eta hondar proteina monomerikoaren gehiegizko bat sortu zen. diluzio-prozesuaren emaitza (ikusi AC kurbak 7b irudian, ezkerreko panelean).Disoluzio-baldintza berdinetan egindako kontrol-esperimentuek proteina monomerikoak soilik dituzten laginak erabiliz ez zuten CC kurbarik erakutsi, eta AC kurbak ondo egokitzen dira osagai bakarreko difusio-ereduarekin (4. ekuazioa), non proteina monomerikoek espero diren difusio-koefizienteak dituzten (7b. irudia). ), eskuineko panela).Agregatutako partikulen difusio-koefizientea 1 µm2/s baino txikiagoa da eta proteina monomerikoena 1 µm2/s ingurukoa da.50-100 µm/s;balioak aldez aurretik argitaratutako balioen antzekoak dira αS fibril amiloide sonikatuentzat eta αS monomerikoa bereizita, antzeko soluzio baldintzetan44.Agregatuak TCCD leherketa analisiarekin (7c. irudia, goiko panela) aztertu genituenean, agregatu isolatu bakoitzean (αS/Tau heteroagregatua), detektaturiko agregatuen % 60 inguruk αS eta tau zeudela ikusi genuen, % 30 inguruk bakarrik zeudela. tau, % 10 inguru αS bakarrik.αS/Tau heteroagregatuen analisi estekiometrikoak erakutsi zuen heteroagregatu gehienak tau-n aberastu zirela (0,5etik beherako estekiometria, agregatu bakoitzeko tau molekularen batez besteko kopurua αS molekulak baino 4 aldiz handiagoa da), eta hori bat dator FLIM in situ-en ikusitako lanarekin. esperimentuak..FRET azterketak erakutsi zuen agregatu hauek bi proteinak zeudela, nahiz eta kasu honetan benetako FRET balioek garrantzi handirik izan, agregatu bakoitzean fluoroforoen banaketa ausazkoa izan zelako esperimentuan erabilitako etiketarik gabeko proteina gehiegizkoaren ondorioz.Interesgarria da analisi bera egin genuenean 45,46 amiloide-agregazio-urritasuneko Tau aldaera heldua erabiliz (ikus 11a, b irudi osagarria), ohartu ginen αS agregazio elektrostatikoa berdina izan bazen ere (11c, d irudi osagarria), Koazerbatuaren barruan agregatuak sortzeko gaitasuna izugarri murriztu zen eta FLIMek hainbat puntu detektatu zituen in situ esperimentuetan, eta korrelazio gurutzatuaren kurba ahulak ikusi ziren agregatu lagin isolatuetan.Hala ere, detektaturiko agregatu kopuru txiki baterako (Tau441-en hamarren bat bakarrik), agregatu bakoitza Tau aldaera hau baino αS-n aberastu zela ikusi genuen, gutxi gorabehera detektaturiko agregatuen % 50ak αS molekulak baino ez zituela, eta αS heterogeneoa zen gehiegitan. .agregatuak (ikus 11e irudi osagarria), Tau441-ek sortutako agregatu heterogeneoen aldean (6f. irudia).Esperimentu horien emaitzek erakutsi zuten αS bera koazerbatuaren barruan tau-rekin metatzeko gai den arren, tau-nukleazioa mesedegarriagoa dela baldintza horietan, eta ondoriozko amiloide-itxurako agregatuak αS eta tau-ren forma gisa jarduteko gai direla.Dena den, tau-aberatsa den nukleoa eratuta, αS eta tau-ren arteko elkarrekintza heterotipikoak hobetzen dira agregatuetan tau molekulen arteko elkarrekintza homotipikoen aldean;proteina-sareak ere behatzen ditugu αS/tau koazerbato likidoetan.
a αS/Tau441 koazerbato elektrostatikoetan eratutako agregatu isolatuen molekula bakarren fluoreszentzia denborazko arrasto adierazgarriak.αS/Tau441 koagregazioei dagozkien eztandak (adierazitako atalasearen gainetik leherketak) hiru detekzio kanaletan ikusi dira (AF488 eta Atto647N igorpena kitzikapen zuzenaren ondoren, marra urdinak eta gorriak, Atto647N igorpena zeharkako kitzikapenaren ondoren), FRET, marra bioleta).b LLPStik lortutako αS/Tau441 agregatu isolatuen lagin baten FCS/FCCS analisia (ezkerreko panela).AF488 eta Atto647N-ren autokorrelazio-kurbak (AC) kurbak urdinez eta gorriz erakusten dira, hurrenez hurren, eta bi koloratzaileak dituzten agregatuei lotutako korrelazio gurutzatua (CC) kurbak morez erakusten dira.AC kurbak etiketatutako proteina-espezie monomerikoen eta agregatuen presentzia islatzen du, CC kurbak etiketa bikoitzeko agregatuen difusioa soilik erakusten du.Analisi berdina, baina leku isolatuetan bezalako soluzio-baldintza berdinetan, αS eta Tau441 monomerikoak soilik dituzten laginak kontrol gisa erakusten dira eskuineko panelean.c αS/Tau441 koazerbato elektrostatikoetan eratutako agregatu isolatuen molekula bakarren fluoreszentzia flash-analisia.Lau errepikapen desberdinetan (N = 152) aurkitutako agregatu bakoitzaren informazioa haien estekiometriaren, S balioen eta FRETaren eraginkortasunaren arabera marraztu da (goiko panelak, kolore-barrak agerraldia islatzen du).Hiru agregatu mota bereiz daitezke: -αS-bakarrik S~1 eta FRET~0 duten agregatuak, Tau-soilik S~0 eta FRET~1 dituzten agregatuak eta Tau/αS agregatu heterogeneoak tarteko S eta FRET-ekin Zenbatekoaren estimazioak. agregatu heterogeneo bakoitzean detektatu diren bi proteina markatzaileak (N = 100) beheko panelean agertzen dira (kolore-eskalak agerraldia islatzen du).Datu gordinak datu gordinak fitxategi moduan ematen dira.
Proteina likidoen kondentsatuen heltzea edo zahartzea gel-itxurako edo egitura solidoetan denboran zehar kondentsatuaren hainbat funtzio fisiologikotan parte hartzen duela jakinarazi da47 eta baita gaixotasunetan ere, amiloideen agregazio aurreko prozesu anormal gisa 7, 48, 49. Hemen. faseen bereizketa eta portaera zehatz-mehatz aztertzen ditugu.LSPT αS ausazko polikatioien presentzia kontrolatutako ingurune batean mikromolar-kontzentrazio baxuetan eta fisiologikoki garrantzitsuak diren baldintzetan (kontuan izan αS-ren kontzentrazio fisiologiko kalkulatua > 1 µM50 dela), LPS-ren portaera termodinamiko tipikoa jarraituz.αS, pH fisiologikoan oso negatiboki kargatutako C-terminal eskualdea duen eskualdea duen αS gai dela disoluzio uretan proteina ugariko tantak eratzeko gai da LLPS bidez desordenatuta dauden peptido oso katioikoen aurrean, hala nola pLK edo Tau elektrostatiko prozesuaren bidez. kondentsazio konplexua agregazio makromolekularen aurrean.Prozesu honek efektu garrantzitsuak izan ditzake ingurune zelularrean, non αS-k bere gaixotasunarekin lotutako agregazioarekin lotutako hainbat molekula polikaziokorekin topatzen dituen in vitro zein in vivo51,52,53,54.
Ikerketa askotan, tanten barruan proteina-dinamika heltze-prozesua zehazten duen faktore nagusietako bat izan da55,56.αS elektrostatikoko polikazioekin koazerbatuetan, itxuraz, heltze-prozesua polikatioekiko elkarrekintzen indarraren, balentziaren eta elkarrekintza horien aniztasunaren araberakoa da.Oreka teoriak iradokitzen du bi egoera likidoko oreka paisaia bat LLPS gidatzen duten biopolimeroetan aberatsa den tanta handi baten presentzia izango litzatekeela57,58.Tanta-hazkundea Ostwald-en heltzea59, koaleszentzia60 edo sakabanatuta dagoen monomero librearen kontsumoaren bidez61 lor daiteke.αS eta Tau441, ΔNt-Tau edo pLK-rako, proteina gehiena kondentsatuan kontzentratu zen ikerketa honetan erabilitako baldintzetan.Hala ere, tamaina osoko tau tantak gainazalean bustitzean azkar batu ziren bitartean, tanten koaleszentzia eta bustitzea zailak izan ziren ΔNt-Tau eta pLKrentzat, bi sistema hauetan propietate likidoen galera azkarra iradokiz.Gure FLIM-FRET analisiaren arabera, pLK eta ΔNt-Tau tanta zaharrek jatorrizko tanten antzeko proteina-agregazio-maila (fluoreszentziaren iraupenaren antzekoa) erakutsi zuten, jatorrizko proteina-sarea mantendu zela iradokiz, zurrunagoa izan arren.
Gure emaitza esperimentalak hurrengo ereduan arrazionalizatzen ditugu (8. Irudia).Hasieran aldi baterako eratutako tantak sarritan konpentsazio elektrostatikorik gabeko proteina-sareak izaten dira, eta, beraz, karga desoreka-eremuak daude, batez ere tanten interfazean, azalera elektrostatiko handiko potentziala duten tantak sortzen direlarik.Karga konpentsatzeko (balentzia agortzea deritzogun fenomenoa) eta tanten gainazaleko potentziala minimizatzeko, tantek diluitutako faseko polipeptido berriak sar ditzakete, proteina-sareak berrantola ditzakete karga-karga elkarrekintzak optimizatzeko eta beste tanta batzuekin elkarreragin.gainazalekin (bustitzea).αS/pLK tantak, proteina-sare sinpleagoagatik (αS eta pLK-ren arteko interakzio heterotipikoak soilik) eta proteina-proteinen arteko elkarreraginekiko afinitate handiagoagatik, badirudi kondentsatuaren karga azkarrago orekatzeko gai direla;izan ere, hasieran sortutako αS/pLK koazerbatoetan proteina-zinetika azkarragoa ikusi dugu αS/Tau-n baino.Balentzia agortu ondoren, elkarrekintzak ez dira hain iragankorrak bihurtzen eta tantak bere propietate likidoak galtzen ditu eta gel-itxurako, sukoiak ez diren tantak bihurtzen dira, gainazal potentzial elektrostatiko txikia dutenak (eta, beraz, gainazala busti ezin dutenak).Aitzitik, αS/Tau tantak ez dira hain eraginkorrak tanten karga-oreka optimizatzeko proteina-sare konplexuagoengatik (interakzio homotipiko zein heterotipikoekin) eta proteina-interakzioen izaera ahulagoa delako.Honen ondorioz, denbora luzez likidoaren portaera mantentzen duten eta gainazal potentzial elektrostatiko handia erakusten duten tantak sortzen dira, batu eta haziz (horrela, tanten azalera/bolumen erlazioa minimizatuz) eta gainazaleko kimika hidrofiloa bustiz txikiagotu ohi dena.Honek proteina-liburutegi kontzentratu handiak sortzen ditu, fluidoen propietateak mantentzen dituztenak, elkarrekintzak oso iragankorrak izaten jarraitzen baitute proteina sarean karga optimizatzeko etengabeko bilaketaren ondorioz.Interesgarria da Tau-ren N-terminal moztutako formek, naturan dauden isoforma batzuk barne62, tarteko portaera erakusten dute, αS-rekin koazerbatu batzuek iraupen luzeko gel-itxurako tantetan zahartzen direlarik, beste batzuk kondentsatu likido handietan bihurtzen diren bitartean.αS elektrostatikoen koazerbatuen heltzearen bikoiztasun hori bat dator azken LLPS ikerketa teoriko eta esperimentalekin, kondentsatuetan balentzia agortzearen eta bahe elektrostatikoen arteko korrelazioa identifikatu duten kondentsatuen tamaina eta fluidoen propietateak kontrolatzeko gako gisa.Mekanismoa 58.61.
Eskema honek LLPS eta LSPT bidez αS eta Tau441-en amiloideen agregazio-bidea erakusten du.Anioi aberatsak (gorria) eta katioi aberatsak (urdina) eskualde gehigarriekin, balentzia egokia duten αS eta tau elektrostatiko koazerbatoek gainazaleko energia txikiagoa dute eta, beraz, koaleszentzia txikiagoa dute, tantaren zahartze azkarraren ondorioz.Aglomeratu gabeko gel egoera egonkorra lortzen da..Egoera hau oso aldekoa da αS/pLK sistemaren kasuan, bere afinitate handiagoagatik eta proteina-bikote elkarreragin-sare sinpleagoagatik, gel itxurako trantsizio azkarra ahalbidetzen duena.Aitzitik, balentzia desegokia duten tantek eta, beraz, elkarrekintzarako dauden proteinaz kargatutako eskualdeek, koazerbatuak erraztu egiten dute gainazal hidrofiloa fusionatzea eta bustitzea, bere gainazaleko energia handia murrizteko.Egoera hau hobetsi da αS/Tau441 koazerbatoentzat, Tau-Tau eta αS-Tau interakzio ahulek osatutako sare konplexu anitzeko balio dutenak.Era berean, koazerbato handiagoek errazago mantenduko dituzte fluidoen antzeko propietateak, proteina eta proteina arteko elkarrekintzak gertatzeko aukera emanez.Azkenean, αS eta tau duten agregatu heterogeneo amiloideak eratzen dira fluido koazerbatuaren barruan, gaixotasun neuroendekapenezkoen ezaugarri diren inklusio-gorputzetan aurkitzen direnekin erlazionatuta egon daitezkeenak.
αS/Tau441-en heltzean sortutako fluido-itxurako egitura handiak proteina-ingurune oso kongestionatu baina dinamikoarekin eta, neurri txikiagoan, αS/ΔNt-Tau koazerbatoak gordailu aproposa dira proteina-agregazioa nukleatzeko.Hain zuzen ere, proteina-agregatu solidoen eraketa ikusi dugu proteina koazerbato mota honetan, sarritan αS eta tau dituztenak.Heteroagregatu hauek elkarrekintza ez-elektrostatikoen bidez egonkortzen direla frogatu dugu, amiloidearen ThT koloratzaile espezifikoak lotzeko gai direla amiloide-fibril tipikoen modu berean eta, hain zuzen ere, hainbat eraginekiko antzeko erresistentzia dutela.LLPS-ek eratutako αS/tau agregatuek amiloide antzeko propietateak dituztela frogatu zen.Izan ere, amiloideen agregazioan eskas den Tau aldaera heldua nabarmen hondatzen da αS agregatu heterogeneo horien eraketan koazerbato elektrostatiko likidoaren barruan.αS/Tau441 agregatuen eraketa koazerbatoen barruan bakarrik ikusi zen, likido-itxurako propietateak gordetzen baitzituzten, eta inoiz ez, koazerbato/tantak gel-egoerara iristen ez baziren.Azken kasu honetan, elkarreragin elektrostatikoen indarra areagotzeak eta, ondorioz, proteina-sarearen zurruntasunak proteinen beharrezko konformazio berrantolaketak saihesten ditu amiloidearen nukleaziorako beharrezkoak diren proteina-interakzio berriak ezartzeko.Hala ere, hori likido-itxurako koazerbato malguagoetan lor daiteke, eta, aldi berean, likido geratzen dira tamaina handitu ahala.
Kondentsatutako fasearen barruan agregatuak sortzea hobe da αS/Tau kondentsatu handietan azkar gelifikatzen diren tanta txikietan baino, tantaren koaleszentzia kontrolatzen duten faktoreak identifikatzearen garrantzia nabarmentzen du.Beraz, faseak bereizteko joera ez ezik, kondentsatuaren tamaina kontrolatu behar da funtzionamendu egokia izateko eta baita gaixotasunen prebentziorako58,61.Gure emaitzek ere nabarmentzen dute LLPS eta LSPT arteko orekaren garrantzia αS/Tau sistemarako.Tanta-eraketak amiloideen agregazioaren aurka babesten badu ere, saturazio baldintzetan eskuragarri dauden proteina monomeroen kopurua murriztuz, beste sistema batzuetan proposatu den bezala63,64, tanta-maila altuetan tanta-fusioak barne-proteinen agregazioa ekar dezake konformazio berrantolaketa motelen bidez.proteina-sareak..
Orokorrean, gure datuek indar handiz azpimarratzen dute balentzia kohesionatuaren eta LSPT-ren testuinguruan tanta-sareetako elkarrekintza ase/atseginen garrantzia.Bereziki, erakusten dugu luzera osoko αS/Tau441 kondentsatuek modu eraginkorrean fusionatzeko eta nukleatzeko gai direla bi proteinak barne hartzen dituzten amiloide antzeko heteroagregatuak sortzeko eta gure emaitza esperimentaletan oinarritutako mekanismo molekular bat proposatzen dutela.Hemen jakinarazten dugun αS/Tau fluido koazerbatuan bi proteinen ko-agregazioa inklusioetan bi proteinen ko-lokalizazioarekin erlazionatuta egon daiteke, gaixotasunaren ezaugarriak direnak, eta LLPS eta LLPSen arteko erlazioa ulertzen lagun dezake. amiloideen agregazioa, karga handiko IDPrako bidea irekiz neurodegenerazioan.
WT-αS monomerikoak, zisteina mutanteak (Q24C-αS, N122C-αS) eta ΔCt-αS aldaerak (Δ101-140) E. coli-n adierazi eta aurretik deskribatu bezala purifikatu ziren.5 mM DTT αS zisteina mutanteen arazketako urrats guztietan sartu zen disulfuro lotura eratzea saihesteko.Tau441 isoforma (Adgene #16316-tik lortutako plasmidoa), ΔNt-Tau aldaera (Δ1–150, IVA klonatuz lortutako CTTTAAGAAGGAGATACATATGATCGCCACACCGCGG, CATATGTATATCCTCTCTTCTTAAAGTTAAAC) eta AggDef-Tau aldaera-purifikatua (G31TC, ΔGCcoli 125-en arazpenekin) (E31TC, 5 coli purifikatuekin). OD600 = 0,6-0,7ra hazi zen 37 °C eta 180 rpm-ra, eta adierazpena IPTGrekin induzitu zen 37 °C-tan 3 orduz.Hartu zelulak 11.500 xg-tan 15 minutuz 4 °C-tan eta garbitu 150 mM NaCl duen gatz tamponarekin.Suspendu pelleta lisi-buffer batean (20 ml 1 L LB bakoitzeko: MES 20 mM, pH 6,8, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 0,2 ​​mM, DTT 5 mM, PMSF 1 mM, benzamidina 50 μM, kopeptina μM100).Sonicazio urratsa izotzean egin zen % 80ko anplitudearekin 10 pultsutan (min 1 piztuta, 1 min off).Ez gainditu 60 ml ultrasoinu batean.E. coli lysateak 95° C-tan berotu ziren 20 minutuz, gero izotzetan hoztu eta 127.000 × g-tan zentrifugatu ziren 40 minutuz.Argitutako gainditzailea 3,5 kDako mintz batean aplikatu zen (Spectrum™ Thermo Fisher Scientific, Erresuma Batua) eta 4 L dialisi tamponaren aurka dializatu zen (20 mM MES, pH 6,8, NaCl 50 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 2 mM, DTT 2 mM). , PMSF 0,1 mM) 10 orduz.5 ml-ko katioi-truke zutabe bat (HiTrap SPFF, Cytiva, MA, AEB) oreka-buffer batekin orekatu zen (20 mM MES, pH 6,8, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Tau lysate 0,22 μm PVDF iragazki batetik iragazi zen eta zutabean injektatu zen 1 ml/min-ko emariarekin.Eluzioa apurka-apurka egin zen, tau eluzio-tampon % 15-30arekin (20 mM MES, pH 6,8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM MgCl2, 2 mM DTT, 0,1 mM PMSF).Zatikiak SDS-PAGE bidez aztertu ziren, eta tau-ren pisu molekularra zuen banda bat zuten frakzioak 10 kDa zentrifugatzaile-iragazki batekin kontzentratu ziren eta 10 mM HEPES, pH 7,4, NaCl 500 mM eta DTT 2 mM zituen buffer batekin ordezkatu ziren. azken proteina-kontzentrazioa 100 μM izan zen.Proteina-disoluzioa 0,22 μm-ko PVDF iragazki batetik pasatu zen, azkar izoztu eta -80 °C-tan gorde zen.K18 proteina Alberto Boffi irakasleak atsegin handiz eman zuen.Prestakuntzaren purutasuna % 95ekoa izan zen SDS-PAGE eta MALDI-TOF/TOF-ek baieztatu dutenez.Hainbat zisteina kimikoki etiketatu ziren AlexaFluor488-maleimidarekin (AF488, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, AEB) edo TEMPOL-maleimidarekin (Toronto Research Chemicals, Toronto, Kanada).absorbantzia eta MALDI-TOF/TOF bidez baieztatu ziren.Tau441, ΔNt-Tau, AggDef-Tau eta K18 bertako zisteina-hondakinekin etiketatu ziren 191 eta 322 posizioetan Atto647N-maleimida erabiliz (ATTO-TEC GmbH, Siegen, Alemania) prozedura bera jarraituz.αS eta Tau441 hondakinen mapa bakoitzeko karga garbia CIDER66 erabiliz sortu zen.
Poli-L-lisina solidoa (pLK DP 90-110 hornitzailearen NMRren arabera, Alamanda Polymers Inc, Huntsville, Alabama, AEB) 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7,4 eta 10 mM kontzentrazioan disolbatu zen, prozesua 5etarako sonikatuta. minutu ur-bainu ultrasoinu batean eta gorde -20 °C-tan.PEG-8, dextrano-70, FITC-PEG-10 (Biochempeg, Watertown, MA, AEB) eta FITC-dextrano-500 (Sigma -Aldrich, Sant Louis, MI, AEB) ur disolbagarriak dira eta LLPS tamponean oso banatuta daude.Dialisiak gatz kutsatzaileak kentzen ditu.Ondoren, 0,22 μm-ko poro-tamaina duen xiringa-iragazki batetik iragazi ziren, eta haien kontzentrazioa errefraktometro baten bidez kalkulatu ziren (Mettler Toledo, Columbus, Ohio, AEB).LLPS laginak giro-tenperaturan prestatu ziren ordena honetan: tampona eta estrusioa nahastu ziren eta 1 mM tris(2-karboxietil)fosfina (TCEP, Carbosynth, Compton, UK), 1 mM 2,2,2,2-(Etano-). 1, 2-diildinitrilo) azido tetraacetikoa (EDTA, carboxynth) eta %1 proteasaren inhibitzaileen nahasketa bat (PMSF 100 mM, benzimida 1 mM, leupeptina 5 μM).Ondoren, αS eta polikatio fusionatuak (pLK edo Tau aukerak) gehitzen dira.Tioflabina-T denbora serieko esperimentuetarako (ThT, Carbosynth, Compton, UK), erabili ThT kontzentrazio osoa αS kontzentrazioaren erdia izateko.Poliki-poliki baina ondo nahastu laginak homogeneoak direla ziurtatzeko.Osagai bakoitzaren kontzentrazioa esperimentu batetik bestera aldatu egin zen, Emaitzak atalean azaltzen den bezala.Azida % 0,02ko kontzentrazioan erabili zen (p/v) esperimentuaren iraupena 4 ordutik gorakoa zen bakoitzean.LLPS laginak erabiliz analisi guztietan, utzi nahastea orekatzen analisia egin baino 5 minutuz.Argia sakabanatzearen analisirako, 150 µl lagin kargatu ziren lotesleak ez ziren 96 hobietako mikroplaketan (µClear®, beltza, F-Bottom/Chimney Well, Greiner bio-one, Kremsmünster, Austria) eta film itsasgarriz estali ziren.LLPak disoluzioaren erdian 350 nm-ko absorbantzia neurtuz kontrolatu ziren CLARIOstar plaka irakurgailu batean (BMG Labtech, Ortenberg, Alemania).Esperimentuak hiru aldiz egin ziren 25 °C-tan, eta akatsak batez bestekoaren desbideratze estandar gisa kalkulatu ziren.Fase diluitua laginaren zentrifugazioaren eta SDS-PAGE gelaren analisiaren bidez kuantifikatu zen, eta fase diluitu eta kontzentratuetan αS frakzioa LLPS disoluzio ezberdinetan kuantifikatu zen.1 μM AF488-rekin etiketatutako αS zuen 100 μl LLPS lagin bat prestatu zen nahasketa sakonarekin eta ondoren 9600 × g-tan zentrifugatuz 30 minutuz, eta ondoren prezipitatua ikusten zen normalean.Gainaren goiko 50 μl proteinak kuantifikatzeko erabili ziren SDS-PAGE gelaren bidez.Gelak AF488 iragazkiekin eskaneatu ziren ChemiDoc gel bidezko irudi-sistema erabiliz (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, AEB) edo Coomassie orbanarekin tindatu eta iragazki egokiekin bistaratu ziren.Sortutako bandak ImageJ 1.53i bertsioa erabiliz aztertu ziren (National Institutes of Health, AEB).Esperimentuak bikoiztuta egin ziren antzeko emaitzak dituzten bi esperimentu ezberdinetan.
Normalean, 150 μl lagin lotzen ez diren 96 putzuko mikroplaketan aplikatu eta giro-tenperaturan bistaratzen ziren Leica DMI6000B alderantzizko mikroskopio batean (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania).Lekuko esperimentuetarako, µ-Slide Angiogenesis plakak (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemania) edo 96 putzuko poliestirenozko mikroplakak (Corning Costar Corp., Acton, Massachusetts) ere erabili ziren.EL6000 halogeno edo merkurio metalezko halogenuroko lanparak erabili ziren argiztapen iturri gisa (BF/DIC eta WF irudietarako, hurrenez hurren).WF mikroskopiorako, 40x handitze-ko aire-objektibo bat erabili zen (Leica Microsystems, Alemania) argia laginaren gainean fokatu eta biltzeko.AF488 eta ThT etiketatutako laginetarako, iragazi kitzikapena eta igorpena GFP iragazki-multzo estandarrekin, kitzikapen eta igorpen banda-iragazkiak, hurrenez hurren, 460-500 nm eta 512-542 nm-ko banda-iragazkiak eta 495 nm-ko ispilu dikroiko batekin.Atto647N-rekin etiketatutako laginetarako, Cy5 iragazkien multzo estandar bat erabili zen, hurrenez hurren, 628-40 nm eta 692-40 nm-ko kitzikapen eta igorpen banda-iragazkiak dituzten eta 660 nm-ko ispilu dikroiko bat.BF eta DIC mikroskopiorako, erabili islatutako argia biltzeko helburu bera.Bildutako argia Leica DFC7000 CCD kamera batean grabatu zen (Leica Microsystems, Alemania).Esposizio-denbora 50 ms-koa izan da BF eta DIC mikroskopio-irudietarako eta 20-100 ms-ko WF mikroskopio-irudietarako.Konparazio baterako, ThT-rekin egindako esperimentu guztien esposizio-denbora 100 ms-koa izan zen.Time-lapse esperimentuak egin ziren tanten koaleszentzia ikusteko, eta irudiak 100 ms behin biltzen ziren hainbat minutuz.Irudien analisirako ImageJ (NIH, AEB) erabili da.Esperimentuak hirukoiztuta egin ziren antzeko emaitzekin.
Kokalizazio esperimentuetarako, FRAP eta 3D berreraikitzeko, irudiak Zeiss LSM 880 alderantzizko mikroskopio konfokal batean eskuratu ziren ZEN 2 edizio urdina erabiliz (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemania).50 µl-ko laginak µ-Slide Angiogenesis Petri plaketan (Ibidi GmbH, Gröfelfing, Alemania) aplikatu ziren, polimero hidrofilo batekin (ibiTreat) tratatu eta 63× olio-murgiltze helburu batean muntatu ziren (Plan-Apochromat 63×/NA 1.4 Oil) DIC-n).Irudiak 458 nm, 488 nm eta 633 nm-ko argon laser-lerroak erabiliz eskuratu ziren 0,26 µm/pixeleko bereizmenarekin eta 8 µs/pixeleko esposizio-denbora 470-600 nm, 493-628 nm-ko kitzikapen eta emisioak detektatzeko leihoetarako. eta 638-755 nm erabili ziren ThT, AF488 eta Atto647N ikusteko, hurrenez hurren.FRAP esperimentuetarako, lagin bakoitzaren time-lapse argazkia grabatu zen segundoko fotograma batean.Esperimentuak hirukoiztuta egin ziren giro-tenperaturan antzeko emaitzekin.Irudi guztiak Zen 2 blue edition softwarea erabiliz aztertu ziren (Carl Zeiss AG, Oberkochen, Alemania).FRAP kurbak normalizatu, marraztu eta irudietatik ateratako intentsitate/denbora datuetara egokitu ziren Zen 2 erabiliz OriginPro 9.1 erabiliz.Berreskuratze-kurbak eredu mono-esponentzial batera egokitu ziren difusio molekularra kontuan hartzeko termino esponentzial gehigarri batekin eskurapen zuritze-efektua kontuan hartzeko.Ondoren, D kalkulatu dugu zuritzeko erradio nominala eta aurrez zehaztutako berreskurapen-erdi-bizitza erabiliz Kang et al-en ekuazioan bezala.5 35 erakusten.
αS-ren zisteina bakarrak 4-hidroxi-2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-oxyl (TEMPOL) 24 (TEMPOL-24-αS) eta 122 (TEMPOL-122-αS) posizioetan sintetizatu ziren. hurrenez hurren.Spin Labeling EPR esperimentuetarako, αS kontzentrazioa 100 μM-n ezarri zen eta PEG kontzentrazioa % 15ekoa izan zen (w/v).Agregazio-baldintza ezberdinetarako, αS:pLK ratioa 1:10 izan zen, αS:ΔNt-Tau eta αS:Tau441 ratioak 1:1ean mantendu ziren bitartean.Pilaketarik ezean titulazio-esperimentuak lotzeko, TEMPOL-122-αS 50 μM-tan mantendu zen eta polikatzioak kontzentrazio handituz titulatu ziren, baldintza bakoitza bereizita prestatuz.CW-EPR neurketak Bruker ELEXSYS E580 X bandako espektrometroa erabiliz egin dira, Bruker ER4118 SPT-N1 erresonagailu batekin hornituta, ~9,7 GHz-ko mikrouhin-labean (SHF) maiztasunean funtzionatzen duena.Tenperatura 25 °C-tan ezarri zen eta nitrogeno likidoaren kriostato baten bidez kontrolatu zen.Espektroak baldintza asegabeetan lortu ziren 4 mW-ko MW-ko potentzian, 0,1 mT-ko modulazio-anplitudean eta 100 kHz-ko modulazio-maiztasunean.Intentsitate espektralak normalizatu ziren laginen arteko spin-kontzentrazioen desberdintasunak eta spin-murrizketa posiblea saihesteko, Tau441 edo ΔNt-Tau (jatorrizko proteina-disoluzioetan) dauden laginetako agente murrizteen hondar-kontzentrazioengatik.Emandako g-ren balioak Matlab®67-n inplementatutako Easyspin softwarea (v. 6.0.0-dev.34) erabiliz egindako EPR modelizazio espektralaren ondorioz lortu ziren.Datuak modelatzeko osagai bateko/biko eredu isotropikoak erabili dira.Seinale guztiak normalizatu ondoren, hondarrak kalkulatu ziren simulazio bakoitza dagokion espektro esperimentaletik kenduz.Titulazio lotunearen analisirako, hirugarren bandaren intentsitate erlatiboa EPR espektro normalizatuaren bigarren bandaren (IIII/III) erabili zen αS-rekin polikatioien lotura kontrolatzeko.Disoziazio-konstantea (Kd) estimatzeko, ondoriozko kurba n lotura-gune berdin eta independenteak suposatzen duen gutxi gorabeherako eredu batera egokitu da.
RMN espektroskopia esperimentuak krio-zundak eta Z-gradientez hornitutako Bruker Neo 800 MHz (1H) RMN espektrometro batekin egin ziren.Esperimentu guztiak 130-207 µM αS eta dagozkion αS/ΔNt-Tau eta pLK baliokideak erabiliz egin ziren 10 mM HEPES, 100 mM NaCl, % 10 DO, pH 7,4 eta 15 °C-tan egin ziren.LPS NMR bidez monitorizatzeko, % 10 PEG gehitu zen aurrez nahastutako laginei.Desplazamendu kimikoen perturbazio grafikoak (1b. irudia) 1H eta 15N batez besteko desplazamendu kimikoak erakusten ditu.αS 2D1H-15N HSQC espektroak aurreko esleipen batean oinarrituta esleitu ziren (BMRB sarrera #25227) eta HNCA, HNCO eta CBCAcoNH-en 3D espektroak grabatu eta aztertuz baieztatu ziren.13Cα eta 13Cβ desplazamendu kimikoak ΔNt-Tau edo pLKren aurrean kalkulatu ziren bigarren mailako egituraren joeren aldaketa posibleak neurtzeko αS desplazamendu kimikoekin alderatuta 68 ausazko bobina konformazio hutsean (5c irudi osagarria).R1ρ tasak hsqctretf3gpsi esperimentuak grabatuz (Bruker liburutegitik lortutakoak) 8, 36, 76, 100, 156, 250, 400 eta 800 ms-ko atzerapenekin neurtu ziren, eta funtzio esponentzialak intentsitate gailurreko atzerapenetara egokitu ziren. aldiz R1ρ eta bere ziurgabetasun esperimentala zehazteko.
Bi koloreko denboran ebatzitako fluoreszentzia-mikroskopia esperimentuak denboran ebatzitako MT200 fluoreszentzia-mikroskopio konfokal komertzial batean egin ziren (PicoQuant, Berlin, Alemania) denborarekin erlazionatutako fotoi bakarreko zenbaketa gailu batekin (TCSPC).Laser diodoaren burua pultsatuko interleaved kitzikapenerako (PIE) erabiltzen da, izpia modu bakarreko uhin-gida batetik pasatzen da eta 10 eta 100 nW arteko laser potentziarekin sintonizatzen da 481 nm eta 637 nm ispilu dikroiko baten ondoren neurtutako laser-lerroetarako.Honek fotoien zenbaketa-tasa optimoa bermatzen du, fotoien aliasing, photobleaching eta saturazioaren ondorioak saihestuz.μ-Slide angiogenesi estalkiak edo plakak (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemania) zuzenean murgiltze uretan jarri ziren Super Apochromat 60x NA 1.2 lente baten gainean lepoko zuzentzaile batekin (Olympus Life Sciences, Waltham, AEB).488/640 nm-ko ispilu dikroiko bat (Semrock, Lake Forest, IL, AEB) erabili zen habe banatzaile gisa.Fokurik gabeko erradiazioa 50 mikra-ko diametroa duen zulo batek blokeatzen du, gero fokatutako erradiazioa 2 detekzio-bidetan banatzen da 50/50 izpi zatitzaile baten bidez.Bandpass igorpen-iragazkiak (Semrock, Lake Forest, IL, AEB) 520/35 koloratzaile berderako (AF488) eta 690/70 koloratzaile gorrirako (Atto647N) erabili ziren detektagailuaren aurrean.Fotoni bakarreko elur-jausi diodoak (SPAD) (Micro Photon Devices, Bolzano, Italia) detektagailu gisa erabili ziren.Datu-bilketa zein analisia komertzialki eskuragarri dagoen SymphoTime64 softwarea (PicoQuant GmbH, Berlin, Alemania) erabiliz egin dira.
Berrogeita hamar mikrolitro LLPS lagin aplikatu ziren μ-Slide angiogenesi-hobietan (Ibidi GmbH, Gräfelfing, Alemania).Ondorioz, irudiak putzuaren behealdetik 20 µm-ra bideratzen dira esekitako tantetarako lan distantzia objektiborako eta ~1 µm-ra almadia eta puntuetarako, gutxienez 0,25 µm/pixeleko bereizmen axiala eta 400 µs/pixeleko atzerapen-denbora dutenak.Hautatu datuak kanal bakoitzeko batez besteko atzeko seinalearen intentsitatean oinarritutako intentsitate-atalasa bat aplikatuz (PBG, batez bestekoa + 2σ) kanal bakoitzeko, horrela proteina-tanta, baltsa edo orbanak soilik hauta daitezen, fase barreiatuaren jatorri posiblea iragaziz.Kanal bakoitzeko espezie bakoitzaren (τ) bizi-iraupena aztertzeko (berdea, "g" AF488rako eta gorria, "r" Atto647Nrako), tantak, baltsa edo orbanak dituzten interes-eskualdeak (ROI) hautatu ditugu (1. irudi osagarria). ).8b) eta haien bizitzako desintegrazioa (τD, τR eta τP tanta, baltsa edo orbanetarako, hurrenez hurren, ikus 8c irudi osagarria) kanal bakoitzean buztan-egokitzearen analisia eta bi osagaiko desintegrazio-eredua erabiliz lortu zituzten.Batez besteko τ τ-tik.Exponentzial anitzeko egokitzapenerako fotoi gutxiegi ekoizten zituzten ROI-ak analisitik kanpo geratu ziren.Erabilitako ebakidura <104 fotoi izan zen baltsa eta puntuetarako eta 103 tantarako.Tantek atalase baxuagoa dute, zaila delako intentsitate handiko balioekin desintegrazio-kurbak lortzea, irudi-eremuko tantak txikiagoak eta gutxiago ugariak izaten baitira.Fotoien metaketaren mugatik gorako fotoi kopuruak dituzten ROIak (> 500 zenbaketa/pixel) ere baztertu ziren analisirako.Lotu interes-eskualdetik lortutako intentsitatearen desintegrazio-kurba zerbitzu-bizitzaren hasieratik gehienezko % 90eko intentsitatearekin (apurka-apurka gainbeheraren intentsitate maximoaren ondoren), IRF interferentzia minimoa bermatzeko, intentsitateko desintegrazio guztietan berdin mantenduz. ezarpenak Denbora-leiho erlatiboa 25 eta 50 arteko ROI analizatu ziren baltsak eta spotetarako eta 15-25 ROI tantetarako, gutxienez 3 esperimentu independentetan grabatutako 4 erreplika baino gehiagoren artean hautatutako irudiak.Bi isatseko t-probak espezieen arteko edo koazerbato-sistemen arteko desberdintasun estatistikoak ebaluatzeko erabili dira.Bizi-denboraren pixelez pixeleko analisia egiteko (τ), kanal bakoitzaren eremuan zehar bizitza-denboraren guztizko atenuazioa kalkulatu zen eta 2/3 osagaiko atenuazio esponentzialaren eredu baten hurbilketa egin zen.Ondoren, pixel bakoitzaren bizitzako atenuazioa aurrez kalkulatutako τ balioak erabiliz egokitu zen, FLIM fit-irudi pseudokolorea lortuz.Isats-egokitze-bizitza-tartea berdina zen kanal bereko irudi guztietan, eta desintegrazio bakoitzak nahikoa fotoi sortzen zituen egokitze fidagarria emateko.FRET analisirako, pixelak 100 fotoitako intentsitate baxuagoko atalasea aplikatuz aukeratu ziren, 11 fotoitako atzeko planoko seinalea (FBG) batez bestekoa zena.Kanal bakoitzaren fluoreszentzia-intentsitatea esperimentalki zehaztutako zuzenketa-faktoreen bidez zuzendu zen: 69 diafonia espektral α 0,004 zen, zuzeneko kitzikapen β 0,0305, detekzio-eraginkortasuna γ 0,517.Ondoren, pixel mailan FRET eraginkortasuna honako ekuazio hau erabiliz kalkulatzen da:
non FDD kanal emaile (berdean) ikusitako fluoreszentzia intentsitatea den, FDA kanal hartzailean (gorrian) zeharkako kitzikapenean ikusitako fluoreszentzia intentsitatea den eta FAA kitzikapen zuzeneko kanal hartzailean (gorrian) ikusitako fluoreszentzia intentsitatea den ( TARTA).Fluoreszentzia-intentsitate-pultsuak ikusten dira kanalean).
Jarri 100 µl etiketarik gabeko Tau441 monomeriko duten 25 µM (25 µM αSrekin edo gabe) LLPS erreakzio-disoluzio LLPS bufferan (goian bezala osatuta) lotesle gabeko 96 hobiko mikroplaketan, paper itsasgarri estaldura duten eta tanten eraketa WF mikroskopiarekin egiaztatu zen. oreka.10 minutu barru.Giro-tenperaturan 48 ordu inkubatu ondoren, proteina baltsa eta orbanen presentzia baieztatu zen.Ondoren, kontu handiz kendu putzuetatik baltsen gaineko likidoa, gero gehitu 50 L disoziazio buffer (10 mM HEPES, pH 7,4, 1 M NaCl, 1 mM DTT) eta inkubatu 10 minutuz.Gatz kontzentrazio altuak bermatzen du LLPS ez dela errepikatuko hondar PEG dela eta, eta interakzio elektrostatikoek soilik eratutako proteina-multzo posibleak desmuntatu egingo dira.Ondoren, putzuaren hondoa arretaz kendu zen mikropipeta-puntarekin eta lortutako disoluzioa behaketa-putzu huts batera transferitu zen.Laginak 50 μM ThT-rekin 1 orduz inkubatu ondoren, puntu isolatuen presentzia egiaztatu zen WF mikroskopiarekin.Prestatu αS fibrilak sonikatuak 70 µM αS disoluzio baten 300 µl inkubatuz 7,4 pH-an, sodio azida % 0,01 37 °C-tan eta 200 rpm orbital astindu batean 7 egunez.Ondoren, disoluzioa 9600 × g-tan zentrifugatu zen 30 minutuz, pelleta PBS pH 7,4-an berriro eseki eta sonikatu (min 1, % 50eko zikloa, % 80ko anplitudea Vibra-Cell VC130 sonikagailu batean, Sonics, Newton, AEB) fibril laginak. fibrila txikien tamainako banaketa nahiko uniformearekin.
FCS/FCCS analisia eta bi koloretako kointzidentzia detekzioa (TCCD) FLIM-FRET mikroskopia esperimentuetarako erabilitako MT200 denboran ebatzitako mikroskopio konfokal fluoreszente berean (Pico-Quant, Berlin, Alemania) egin ziren PIE modua erabiliz.Esperimentu hauetarako laser potentzia 6,0 µW (481 nm) eta 6,2 µW (637 nm) gehitu zen.Laser-ahalmen horien konbinazioa erabilitako fluoroforo-pareen antzeko distira sortzeko aukeratu zen, zenbaketa-tasa optimoak lortuz eta foto zuritzea eta saturazioa saihestuz.Datu-bilketa zein analisia komertzialki eskuragarri dagoen SymphoTime64 2.3 bertsioko softwarea erabiliz egin dira (PicoQuant, Berlin, Alemania).
LLPS erabiliz lortutako αS/Tau agregatu isolatuen laginak isolamendu-buffer batean diluitzen dira kontzentrazio monomolekular egokian (normalean 1:500eko diluzioa, agregatuak dagoeneko kontzentrazio baxuetan baitaude koazerbato-laginetatik isolatzen direnean).Laginak zuzenean BSA disoluzio batekin estalitako estalkietan (Corning, AEB) aplikatu ziren 1 mg/mL-ko kontzentrazioan.
Kanal berde eta gorrietako PIE-smFRET analisirako, 25 fotoitako intentsitate baxuko atalasea aplikatu zen gertaera monomerikoek eragindako intentsitate baxuko seinaleak iragazteko (kontuan izan monomeroek lagin agregatuak baino gehiago direla agregatu isolatuekin alderatuta).Atalase hori monomero lagin puruen analisitik lortutako αS monomerikoaren batez besteko intentsitatearen bost aldiz kalkulatu da, analisirako agregatuak zehazki hautatzeko.PIE disko zirkuituak, TSCPC datuak eskuratzearekin batera, bizitza osorako haztapen-iragazkia aplikatzea ahalbidetu du, atzeko planoa eta diafonia espektrala ezabatzen laguntzen duena.Goiko atalaseak erabiliz hautatutako erlantzaren intentsitatea buffer-soilik dauden laginen intentsitatea/binaren agerraldiaren histogrametatik zehaztutako batez besteko atzeko seinalea erabiliz zuzendu zen.Agregatu handiekin erlazionatutako leherketek normalean ondoz ondoko hainbat ontzi hartzen dituzte denbora-trazan (1 ms-ra ezarrita).Kasu hauetan, indar maximoko ontzi bat aukeratu zen.FRET eta analisi estekiometrikoak egiteko, teorikoki zehaztutako gamma faktorea γ (0,517) erabili da.Gurutzadura espektrala eta zuzeneko kitzikapen ekarpenak arbuiagarriak dira (esperimentalki zehazten dira) erabilitako kitzikapen-laser potentzian.FRET-en eraginkortasuna eta estekiometria leherketa batean honela kalkulatzen dira.