347 altzairu herdoilgaitzezko hodi kimiko osagai kimikoak, interferoiari erantzuten dioten giza leukozitoen antigeno-A (HLA-A) chaperon proteina berrien identifikazioa gurutzatutako masa espektrometria (CLMS) erabiliz.

Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.CSS laguntza mugatua duen arakatzailearen bertsioa erabiltzen ari zara.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Horrez gain, etengabeko laguntza bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe erakusten dugu.
Diapositiba bakoitzeko hiru artikulu erakusten dituzten graduatzaileak.Erabili atzeko eta hurrengo botoiak diapositibetan zehar mugitzeko, edo amaierako diapositiba kontroladorearen botoiak diapositiba bakoitzean mugitzeko.

Produktuaren Deskribapena

Altzairu herdoilgaitzezko 347L bobina-hodiak, altzairu kalifikazioa: SS347L

Interferonaren seinaleztapen-sistemak zitokinen erantzun sendoa eragiten du inguruneko seinale patologiko patogeno eta intrintseko ugariren aurrean, eta ondorioz interferoiak induzi daitezkeen proteina azpimultzoen indukzioa eragiten du.Interferonak eragindako proteinen domeinuan proteina-proteina interakzio berriak detektatzeko DSS bidezko lotura gurutzatuaren masa-espektrometria (CLMS) aplikatu dugu.Espero diren interferoi-induzigarriak diren proteinez gain, interferoi-induzigarriak diren proteina kanonikoen intermolekular eta intramolekularreko aduktu gurutzatu berriak ere identifikatu ditugu, hala nola MX1, USP18, OAS3 eta STAT1.HLA-A proteinek (H2BFS-HLA-A-HMGA1) koimmunoprezipitazioa erabiliz eta dinamika molekularreko modelizazioa erabiliz gero eta gehiago aztertzen duten interferoi-induzitutako proteina-sareen multzo berri baten balioztatze ortogonalean zentratu ginen.Proteina konplexuaren konformazio-dinamikaren modelizazioak CLMS aurkikuntzetan identifikatutako elkarrekintzak islatzen dituzten hainbat interakzio gune agerian utzi zituen.Elkarrekin, CLMSren ikerketa pilotu bat aurkezten dugu interferoiak eragindako seinaleztapen-konplexu berriak identifikatzeko, eta CLMSaren erabilera zabalagoa espero dugu tumoreen mikroingurunean proteinen elkarrekintzen dinamika berriak identifikatzeko.
Erantzun immune moldakorra hasi baino lehen, ostalariaren berezko defentsa-sistemak mikrobioen aurkako erantzun bat muntatzen du interferoiak (IFN) izeneko jariatutako alfa-helize zitokina-familia baten bidez.I motako IFN klaseek IFNα eta IFNβ zelulen erantzunak aktibatzen dituzte, birusen aurkako, proapoptotiko, proinflamatorio eta antiproliferatibo egoerak barne.Gizakietan, IFNα-ren 13 azpimota ezagutzen dira, guztiak 91. kromosoman bilduta. Harrigarria bada ere, IFNα2 soilik ikertu da erabilera klinikorako.Berriki, arreta berezia jarri zaio IFNα-ren beste azpimoten ikerketei.Azken ikerketa batek erakutsi zuen IFNα14 isoformarik eraginkorrenetako bat dela HBV2 eta GIB-13,4 erreplikazioa murrizteko IFNα2 azpimota kanonikoaren aldean.
I motako interferoi-hartzaileen konplexu aktibatuek (IFNAR1 eta IFNAR2) seinale-transdukzio-jauzi bat abiarazten dutela TYK2 eta JAK15,6 Janus kinasek bideratuta dago.Janus kinasa hauek seinale-transduktoreak eta transkripzio-proteina-aktibatzaileak (STAT1 eta STAT2) fosforilatzen dituzte tirosina-hondakinetan, SH2 domeinuaren bidezko heterodimerizazioa hasteko6.Ondoren, IRF9k STAT heterodimeroak lotzen ditu IFNk estimulatutako 3. faktorearen (ISGF3) genearen (ISGF3) konplexu trimeriko bat eratzeko, zeina nukleora lekualdatu eta interferoi bidez estimulatutako 2000 gene (ISG) baino gehiagoren transkripzioa eragiten duena5,6,7,8.
ISGek berezko sistema immunearen bizkarrezurra osatzen dute, batez ere eraso birikoaren aurrean.Infekzio birikoaren aurkako lehen defentsa-lerro gisa, zelulek proteina zelularren interakzio zabalak azkar zabaltzen dituzte jarduera biologiko ugarirekin.Proteina horien artean, ereduak ezagutzeko errezeptoreak, seinaleztapen-molekulak, transkripzio-faktoreak eta birusen aurkako funtzio zuzenak dituzten proteinak daude, baita erantzun immuneen erregulatzaile negatiboak9.ISG jarduerari buruzko informazio asko pantaila funtzionaletatik dator gainespresio pantailak10,11 edo geneak isilarazteko teknikak (siRNA, RNAi eta CRISPR)12,13, zeinetan ISG indibidualak adierazten edo inhibitzen diren eta haien jarduera hainbat birusetan probatzen den.Ikerketa hauek ISG indibidualen birusen aurkako propietateak zehaztu dituzten arren, ISG bakoitzaren azpian dauden mekanismo molekularrak ezezagunak izaten jarraitzen dute.Orokorrean onartzen da proteina askok zitokina batekin edo gehiagorekin elkarreragiten dutela aktibitate osoa bermatzeko, beraz, ISGek zuzenean elkarreragiten dute edo haien elkarrekintzak proteina zelularren bitartez bideratzen dira.Esate baterako, azken fotogurutzatutako proteomika-azterketa batek ATPase VCP/p97 identifikatu zuen IFITM3 interakzio-kide nagusi gisa, zeinaren inhibizioak akatsak eragiten baititu IFITM3 partikula biralekin 14 lisosomiaren ordenazioan, fakturazioan eta kogarraioan.Inmunoprezipitazioa erabiliz, VAPA, besikulei lotutako proteina bat, kolesterolaren bidezko heltze birikoaren bitartekaritza duen IFITM1/2/3-rekin elkarrekintza-kide gisa identifikatu genuen, eta hori berretsi zuen legamia bi-hibrido-sistema erabiliz.Laguntza zientifikoa 15 , 16 .
Infekzioa eta eraldaketa gaiztoa kentzean parte hartzen duen oinarrizko prozesu biologikoa antigenoaren aurkezpena da, hau da, histokonpatibilitate konplexu nagusien (MHC) molekulen bitartez.Moztutako, goiztiar amaitutako edo gaizki tolestutako proteinen peptidoak (8-12 aminoazido luze) MHC-I heterodimeroan kargatzen dira (MHC-I kate astun eta arinez osatua, β-2-mikroglobulina; β2M) 17,18.Lortutako MHC-I trimero egonkorrak zelulen gainazalera garraiatzen dira, non zelula barneko peptidoak aurkezten dizkiete CD8+ T zelulei (T zelula zitotoxikoak)17.T zelulek patogeno hauek eta tumore espezifikoko antigeno bat daramaten zelulak ezagutzen eta suntsitzen dituzte.Ondorioz, patogenoek eta tumore-zelulek askotan antigenoa aurkezteko prozesua kentzen dute zaintza immunologikoa saihesteko.Horrez gain, MHC-I giza tumoreen % 40-90ean beheranzko erregulazioan dago eta askotan pronostiko txarragoarekin lotzen da19.
Patogenoei erantzuten diharduten geneek azkar aldatu behar dute atseden-egoera eta transkripzio aktibo-egoera batetik.Hori dela eta, hainbat proteina zelularra denbora epe laburrean IFN eskari handiaren erantzunean parte hartuko dutela uste da, kromatina sustatzailearen birmoldaketa eta aldaketa barne 20,21.Ikerketa gehienek IFNren presentzian ISG proteina-bazkide indibidualen identifikazioan zentratu dira.Zelula-sistemetan eredu proteomiko eta transkriptomiko hainbat ikerketak argitu dute IFNk paisaia zelularrean duen eragina.Dena den, interferoiek eragindako dinamika gero eta gehiago ulertzen den arren, oraindik ezer gutxi dakigu ISGen inplikazioari buruz.Interferoiaren seinaleztapenaren konplexutasuna eta denboraren menpeko dinamika kontuan hartuta, bi galdera sortzen dira: (i) posible al da seinaleztapen azkarrean parte hartzen duten proteina anitzeko konplexuak egonkortzea eta harrapatzea, eta (ii) interakzio horiek 3D espazioan mapa daitezke?
Arazo horiei aurre egiteko, disuccinimide suberate bidezko gurutzaketa kimikoa (DSS) inplementatu dugu masa-espektrometriarekin (CLMS) IFNα-k eragindako proteina elkarrekintza sarea eta bere dinamika aztertzeko.DSS-k lotura kobalenteak gehitzen ditu in vivo proteinen eta/edo proteina-konplexuen hondakin hurbilen artean.Ondorengo MS analisiak proteina jakin baten barruko eskualdeen hurbiltasun espaziala islatzen duten gurutzaketa gune espezifikoak erakusten ditu, barne loturak edo proteina-konplexuetako azpiunitateak, elkarrekiko harremanak deitzen direnak.Ikuspegi hau erabiliz, hainbat proteina-proteina konplexu berri identifikatu ditugu, baita interferoiak eragindako proteina anitzeko elkarrekintza sareak ere.Interakzio berri hauen azpimultzo bat gehiago probatuz, H2BFS (H2B histona motako FS; aurrerantzean H2B deitzen dena) eta MDN1 HLA-A-ren kide lotze gisa jokatzen dutela frogatzen dugu.
Flo-1 zelulak hestegorriko adenokartzinomaren in vitro eredu ezagunenetako bat dira, hestegorriko tumoreen ezaugarri nagusiak imitatzen baitituzte22,23.Hala ere, tumore guztiak ez dira immunogenoak, eta Flo-1 zelulek interferoi tratamenduari erantzuten dioten zehazteko, Flo-1 zelulak 10 ng/ml IFNα-rekin tratatu ditugu 72 orduz.Flo-1 zelulek pSTAT1 eta IRF1-en indukzio goiztiarra erakutsi zuten, tratamenduaren ondoren 2 ordura hasi eta 72 orduz jarraituz, IRF1-en maila geldien denboraren araberako jaitsiera batekin (1A Irudia).ISGak (MX1, IFITM1, OAS1/2 eta ISG15) 6 orduren buruan biziki induzitzen zirela aurkitu zen, IFNα-ren fase ertaineko eta berantiarko erantzun klasikoak imitatuz (1A Irudia).Batera, datu hauek iradokitzen dute zelula-eredu hau interferoien erantzunak aztertzeko erabil daitekeela.
Proteinen adierazpen diferentziala Flo-1 zeluletan IFNα tratamenduaren ondoren.(A) 2, 6, 24, 48 eta 72 orduz 10 ng/ml IFNα-rekin tratatutako Flo-1 zeluletan proteinen adierazpena immunoblot bidez aztertu zen adierazitako ISG antigorputzak erabiliz.(B) Coomassie urdinez zikindutako SDS-PAGE gelak zelula osoen laburpenen DSSarekin gurutzatu ondoren adierazitako denbora eta kontzentrazioetarako.(C) Lagin bereko p53(DO-1) antigorputzarekin aztertutako immunoblot adierazgarria, proteinen gurutzaketa-maila ebaluatzeko.
Proteinen arteko interakzio-paisaia in situ harrapatzeko, DSS erabili dugu, oso erabilia den gurutzaketa-agente bat, mintzaren iragazkortasun handia eta erreakzio denbora nahiko laburra direlako.Erreakzio-denbora laburragoak gurutzatutako proteinen agregatu handien sorrera ekiditen laguntzen du, eta horrela, gurutzatzailearen egonkortasuna mantenduz.DSS kontzentrazio optimoa zehazteko eta gehiegizko gurutzaketa saihesteko, lehenik eta behin zelulak 5, 2,5 eta 1 mM DSS-ra jasan genituen 5, 10, 5 eta 30 minutuz, hurrenez hurren, eta Coomassie-z tindatutako SDS-PAGE bidez lisatuen azterketa egin genuen. (datuak ez dira erakusten).Zelula lisatuek oso gurutzatuta daudela dirudi kontzentrazio baxuenean eta denbora laburrenean.Hori dela eta, DSS 1, 0,5 eta 0,1 mM-ra titulatu zen 5 minututan (1B irudia).Crosslinking optimoa 0,5 mM DSS-rekin ikusi zen 5 minutuz, eta baldintza hauek IFNα-rekin tratatutako zeluletarako aukeratu ziren.Horrez gain, 1C irudiak p53 (DO-1) antigorputza erabiliz egindako Western blot bat erakusten du proteinen gurutzaketa-maila ebaluatzeko.
Flo-1 zelulak 10 ng/ml IFNα-rekin tratatu ziren 24 orduz gurutzatzailea gehitu aurretik.Gurutzatutako zelulak, ondoren, bi urratseko proteolisiaren bidez lisatu ziren eta proteinak FASP bidez prozesatu ziren (2. irudia)24,25.Gurutzatutako peptido triptikoak masa-espektrometriaren bidez aztertu ziren (2. irudia).MS/MS espektroak proteina-sekuentziarekin lotzen dira eta MaxQuant26,27-rekin kuantifikatzen dira.Lortutako espektroetatik gurutzatutako peptidoak identifikatu ziren SIM-XL programaren bidez, eta konposatu indibidualak sare konplexu batean konbinatu ziren xQuest28 eta SIM-XL29 kode irekiko informatika software kanalizazioak erabiliz (2. irudia).SIM-XL-k proteina-proteinen arteko elkarrekintzak, barne-kateak eta banakako kateak identifikatzen ditu proteina-nahaste sinple edo konplexuetan eta proteina-egituretako elkarrekintzak ikusteko script-ak eskaintzen ditu.Horrez gain, erreferentzia gurutzatu bakoitza ID puntuazio gisa sailkatzen du MS/MS29 espektroaren kalitatearen arabera.Fidagarritasun handiko hainbat proteina-proteina elkarrekintza eta konplexu identifikatu dira, eta elkarrekintza-multzo berri bat gehiago ikertu da ko-immunoprezipitazioa eta konplexuen konformazio-aldaketak erabiliz dinamika molekularra (MD) modelizazioa erabiliz (2. irudia) 30, 31.
CLMS metodoaren ikuspegi eskematikoa.Flo-1 zelulak 10 ng/ml IFNα-rekin tratatu ziren 24 orduz, eta ondoren in situ proteina gurutzatu zuten DSS erabiliz, eta zelulen lisiarekin eta tripsinizazioarekin.Gurutzatutako laginak Orbitrap masa-espektrometroa erabiliz aztertu ziren eta peptido-aitzindarien zatiketa gehiago lagin ziren LC-MS/MS-n zehar.Lortutako espektroetatik lotuta dauden bi peptido identifikatu ziren Crosslinked Peptides of the Spectrum Recognition Machine (SIM-XL) programa erabiliz, eta konposatu guztiak sare konplexu batean konbinatu ziren kanalizazio konputazionalak erabiliz.Iragazi konfiantza baxuko elkarrekintzak tasa positibo faltsuetan (FDR) puntuazioetan oinarrituta.Fideltasun handiko proteina eta proteina elkarrekintza berri gehiago baieztatu ziren ko-immunoprezipitazioa erabiliz, eta konplexuen konformazio-aldaketak aztertu ziren dinamika molekularra (MD) modelizazioa erabiliz.
Guztira, ~ 30.500 eta ~ 28.500 peptido detektatu ziren MaxQuant erabiliz estimulatu gabeko eta estimulatutako IFNα laginetan, hurrenez hurren (S1 taula osagarria, 3A irudia).Bi kasuetan peptidoen luzeraren banaketak peptido handiagoen proportzio handiagoa erakutsi zuen, gurutzatutako peptidoen presentzia adieraziz (3B, C irudia).Horrez gain, 40-55 tartean peptido handiagoen proportzio handiagoa zegoen IFNα-rekin tratatutako laginetan (3C. irudia).Log2 intentsitatearen aurkako proteinen mapak erakutsi zuen interferoi bidez estimulatutako proteina klasikoak ugarienak zirela tratatu gabeko laginekin alderatuta, MX1, IFIT1/3, OAS2/3, DDX58 eta HLA-F barne (3D irudia).IFNα tratamenduari erantzunez hiru aldiz aberastutako proteinen bideen analisiak Reactome bidearen datu-basea erabiliz erakutsi zuen MHC-I bidezko antigenoaren aurkezpena eta prozesamendua bide nagusiena zela (3E Irudia).Aurreko txostenekin bat etorriz, OAS eta ISG15-ek eta baita IFNα/β eta zitokinen seinaleztapena ere aktibatutako bideen artean zeuden erantzunak.Gainera, lisinaren eta serinaren proteina-lotura espezifikoak identifikatu ziren jatorriz eskuratutako MS/MS espektroetatik SIM-XL erabiliz.Berriki egindako ikerketa batek 9 birus klasetako 20 birus biltzen dituen 104 ISGren berri eman du 5 zelula motatan ISG banakako gainespresio ikerketen meta-analisiaren bidez9.Hala ere, datu-multzo handiak aztertzearen muga konputazionalak gainditzeko, datu multzo txikiago batekin hasi ginen Padaria et al.-ek jakinarazitako IRDS geneen zerrendaren arteko interakzio posibleak aztertzeko, gehienak ISGak.
Diferentzialki adierazitako gurutzatutako proteinak identifikatzea IFNα-ri erantzunez (MaxQuant-etik lortutako datuak).(A) IFNα14 tratatutako eta tratatu gabeko Flo-1 laginetan identifikatutako peptido arrunt eta esklusiboen kopurua adierazten duen Venn diagrama.Tratatu gabeko (B) eta IFNα tratatutako (C) lagin gurutzatuen peptido-luzera banaketa.(D) Tratatu gabeko eta IFNα14 tratatutako Flo-1 zelulen arteko log2 (LFQ intentsitatea) adierazten duen bero-mapa.Ezkerreko panelak IFNα-ren presentzian aktiboki aktibatzen diren proteinak erakusten ditu.(E) Histograma IFNα tratamenduaren ondoren aberasteko 20 bide nagusiak adierazten dituena.Reactome bideko datu-baseak IFNα-ri erantzuten dieten proteinen gorako erregulazioan lau aldiz gehiago aztertu zituen.
Interferoi bidezko ISG estimulazioa ondo dokumentatuta dago, baina maila molekularrean gaizki ulertzen da proteina hauek funtzio biologiko ugaritan nola bukatzen diren.Proteinen arteko elkarrekintzak ikertu ditugu ISG ezagunen arteko konfiantza maila handiarekin.Interesgarria da IFNα tratamenduari erantzunez konplexu handi bat osatzen duten MX1, USP18, ROBO1, OAS3 eta STAT1 proteinak barne dituen sare bat identifikatu genuen (4. irudia, S2 taula) 32,33,34.Garrantzitsuena, elkarrekintza hauek IFNα-rekin tratatutako hirukoiztu guztietan aurkitu ziren eta ez ziren tratatu gabeko laginetan aurkitu, IFNα tratamenduari erantzunez bereziki sortu zirela iradokitzen duena.Jakina da STAT1 transkripzionalki ISG horien adierazpena erregulatzen duela, baina proteina mailan ISGekin duen interakzioa ez da ikertu.STAT1-en kristal-egiturak erakutsi zuen bere domeinu helikidalak (CCD) ez duela parte hartzen DNArekin edo protomeroekin elkarrekintzan dimeroen eraketan35.α-helize hauek elkarreraginak gertatzeko azalera nagusi hidrofiloa eskaintzen duen helize-egitura eratzen dute 35 .Gure CLMS datuetan, STAT1-ekin interakzio gehienak CCD-aren aurreko SH2 domeinuan gertatu zirela ikusi genuen, estekatzailearen domeinuan edo C-terminaleko isatsean (700-708 hondarrak) (4A Irudia).Aurreko ikerketa batek jakinarazi zuen USP18 STAT2-ren CCD eta DNA-loturako domeinuarekin (DBD) lotzen dela eta IFNAR2 I motako interferoi-hartzailearen azpiunitatera kontratatzen dela I motako interferoiaren seinaleztapenaren inhibizioa bideratzeko 24 .Gure datuek ere erakutsi zuten USP18 domeinu katalitikoak STAT1 DBD-rekin elkarreragiten duela (4A,D Irudia), STAT1 eta STAT2-ek USP18 IFNAR2ra erakartzeko papera izan dezaketela iradokitzen du.
Proteina-proteina ISG sarea IFNα-rekin tratatutako gurutzatutako zeluletan identifikatua.(A) 2D interakzio grafikoa proteina-proteina elkarrekintzak erakusten dituena (SIM-XL programan sortutakoa), molekula arteko interakzioak adierazten dituzten lerroekin (gurutze-ebakidura 3.5ean ezarrita).Identitate ezberdinetako domeinuak kolorez markatzen dira32: MX1 domeinua, Dynamin_N (73–249), Dynamin_M (259–547) eta GED (569–660).OAS3 domeinuak: OAS1_C (160-344), OAS1_C (559-745), NTP_transf_2 (780-872) eta OAS1_C (903-108).ROBO1 domeinua, Ig_3 (67–151), I-multzoa (170–258), I-multzoa (262–347), Ig_3 (350–432), Ig_3 (454–529), fn3 (562–646), fn3 (678–758) eta fn3 (777–864).STAT1 eremuak: STAT_int (2–120), STAT_alpha (143–309), STAT_bind (321–458), SH2 (573–657) eta STAT1_TAZ2bind (715–739).(B) Gurutzatutako proteinen (MX1, UBP18, OAS3, ROBO1 eta STAT1) elkarreraginak eta elkarreraginak, hurrenez hurren, urdinez eta gorriz etiketatuta dauden ikusle zirkularra.Lotura gurutzatuaren atalasea 3,5ean ezarri zen.Puntu grafikoek STAT1 interakzio guneak adierazten dituzte MX1 (C), USP18 (D), ROBO1 (E) eta OAS3 (F), baita bi peptidoen arteko K edo S interakzio guneak ere.Irudian, lotura gurutzatuaren puntuazioaren atalasea 3.0-n ezartzen da.(G) STAT1 eta OAS3 DI domeinuen arteko elkarreragin-gune desberdinak PyMol-en beren proteina-egituretan gainjarritako (PyMOL sistema grafiko molekularra, 2.0 bertsioa Schrödinger, LLC.);STAT1 (pdb id: 1bf533) eta OAS3 (pdb id: 4s3n34).) programa.
USP18-ren bi isoforma deskribatu dira gizakietan, gehienbat nukleoan kokatzen den proteina luze bat, eta N-terminal domeinurik gabeko isoforma bat, USP18-sf, zitoplasman eta nukleoan berdin banatuta 36 .Horrez gain, N-muturra egituratu gabe zegoela eta ez duela isopeptidasa jarduerarik edo ISG1537 loturarik behar.Gure ikerketan identifikatutako interakzio gehienak proteinaren N-muturrean kokatu ziren, eta iradokitzen dute elkarrekintza horiek USP18 luzera (4A,D irudia) direla eta, beraz, litekeena da nukleoan gertatzea.Gainera, gure datuek ere adierazten dute N-muturra proteina eta proteina elkarreraginetarako espezializatuta dagoela.IFNAR2 lotzeko gunea 312-368 hondakinen artean dago, eta, nabarmen, konplexuko proteina bat ere ez da eskualde honetara lotzen (4A. irudia) 37,38.Datu hauek batera hartuta, IFNAR2 lotura-domeinua hartzailearen proteinak soilik erabiltzen duela adierazten dute.Horrez gain, OAS3 eta ROBO1 bakarrik aurkitu ziren N-terminalaren eta IFNAR2 lotze gunearen gorako domeinuekin erlazionatuta (4A irudia).
ROBO1 immunoglobulina (Ig) superfamiliari dagokio transmintz-seinale molekulen superfamiliari eta bost Ig domeinuz eta hiru fibronektina (Fn) domeinuz osatuta dago zelulaz kanpoko eskualdean.Zelulaz kanpoko domeinu hauen atzetik mintz-hurbileko eskualde bat eta transmintz-helize bakar bat datoz 39. Zelula barneko eskualde egituratu bat C-muturrean kokatzen da eta proteina efektoreen loturaren bitartekaritza duten sekuentzia-motibo kontserbatuak ditu39.~1100-1600 aminoazidoetatik hedatzen den eskualdea desordenatuta dago gehienbat.MX1-ek ROBO1-ekin elkarreragiten duela Ig, Fn eta zelula barneko domeinuen bidez, STAT1-ekin interakzio gehienak bere CCD, estekatzaile-domeinu eta ROBO1-en C-muturraren artean gertatzen diren bitartean (4A, E irudia).Bestalde, DI, DIII eta OAS3 lotura-eskualdeekiko elkarrekintzak ROBO1 proteinan zehar banatu ziren (4A. irudia).
Oligoadenilato sintasa (OAS) proteina-familiak zelula barneko kate bikoitzeko RNA (dsRNA) onartzen eta lotzen du, konformazio-aldaketak jasaten ditu eta 2′,5′-ri lotutako oligoadenilatoak (2-5 As) sintetizatzen ditu 40 .Hiru OASen artean, OAS3-k dsRNArekiko afinitate handiena duela eta 2-5 As-ren kopuru txikiena sintetizatzen duela ikusi zen, RNasa L aktibatu dezakeela eta, ondorioz, birusaren erreplikazioa mugatu 41 .OAS familia polimerasa beta (pol-β) antzeko nukleotido transferasa domeinuek osatzen dute.Aurretik egindako ikerketek erakutsi dute C-terminal domeinuaren (DIII) jarduera katalitikoa dsRNA-ren lotura-domeinuaren (DI) menpekoa dela, hau da, OAS342 aktibatzeko beharrezkoa dena.OAS3-ren DI eta DII domeinuek CCDrekin eta SH2 eta STAT1 TAD-en arteko lotura-eskualde txiki batekin elkarreragiten dutela ikusi genuen (4A, F irudia).Proteinaren egituran gurutzaketa gune desberdinak gainjartzeak β-orriaren eta DBD STAT1 begiztaren eta OAS3ren DI domeinuan 60-75 hondakinek osatutako poltsiko edo barrunbe ireki baten arteko elkarrekintza agerian utzi zuen (4G. irudia).Konplexuko proteinen orientazioak ere adierazi zuen OAS3-rekin izandako elkarrekintzek ez zuela bere DI domeinuaren DNA lotzeko gaitasuna oztopatu (S1A. irudia).Horrez gain, GTPase MX1-en N-terminal domeinuak elkarreragin handia du OAS3-ren DI eta DIII domeinuekin (4A. irudia).OAS1 eta MX1-en arteko elkarrekintza ere ikusi genuen IFNα-rekin tratatutako hiru errepikapenetan, non OAS1 domeinu bakar batek (katalitikoki aktiboa ere) hiru MX1 domeinuekin elkarreragin zuen (S2A, B irudia).
MX proteinak GTP lotu eta hidrolizatzen duen N-terminal GTPasa domeinu bat duten dineina antzeko GTPasen familia handi baten parte dira, auto-muntaketaren bitartekaritza duen tarteko domeinu bat eta GTPasa (LZ) gisa jokatzen duen C-terminaleko leuzina kremailera baten parte dira. ).domeinu efektore domeinu25,43.MX1 polimerasa birikoen azpiunitateetara lotzen da gene birikoaren transkripzioa blokeatzeko43.Aurretik jakinarazitako legamia bi-hibrido-pantaila batek PIAS1-ri lotutako MX1-ek STAT1 bidezko genearen aktibazioa inhibitzen duela, DNA-lotze-jarduera blokeatuz eta SUMO E344,45 ligasa-jarduera ere badu.Hemen, MX1 STAT1-ekin lotzen dela frogatzen dugu (4C, D irudia), hala ere, elkarrekintza horrek nola eragiten dion STAT1 bidezko genearen aktibazioa IFNα-ri erantzunez.Horrez gain, MX1-ek IFIT3 eta DDX60-ekin elkarreragin zuela ere aurkitu dugu IFNα-rekin tratatutako hiru errepikapenetan (S2C irudia).
DDX60 IFNk eragindako helikasa zitoplasmiko bat da, eta aldez aurretik RNA46 birikoaren RIG-I-ren independentea den degradazioan zeresana duela jakinarazi da.RIG-I-rekin elkarreragiten du eta bere seinaleztapena ligandoen modu espezifikoan aktibatzen du 46. DDX60 ARN birikoa eta DNA lotzen dituen DEXD/H-Box helikasa domeinu batek eta C-terminaleko helikasa domeinu batek osatzen dute47.MX1 eta IFIT3rekin dituen interakzio gehienak N- eta C-terminal eskualde luzeetan gertatzen dira domeinu edo motibo kanonikorik gabe (S2E,F irudia).Hala ere, MX1 DEXD/H-Box helikasa domeinuarekin ere lotuta dago (S2E irudia).IFIT familiako proteinek tetrapeptido errepikapena (TPR) izeneko helize-bihurketa-helize motibo bereizgarri baten tandem kopiak dituzte.IFIT3 RIG-I seinaleztapenaren modulatzaile positiboa zela aurkitu zen eta, beraz, MAVS konplexuaren osagaia.Batera hartuta, gure datuek iradokitzen dute IFIT3 eta DDX60 IFIT3-ren TPR 3-6 arteko eskualdean elkarreragiten dutela batez ere eta RIG-I/MAVS seinaleztapenean zeresana izan dezaketela (S2F irudia).
Proteoma osoa bahetzea konputazionalki intentsiboa dela kontuan hartuta, gero giza UniProt datu-base osoa aztertu genuen IFNα-rekin tratatutako errepikapenetako baten presentzia ikusteko.Erreplika honetan, HLA-Arako elkarrekintza-sare oso fidagarriak aurkitu ditugu.MS/MS espektroek identifikatutako proteinen bideen analisiak erakutsi zuen MHC-I-n oinarritutako antigenoaren prozesamendua eta aurkezpena dela interferoiak eragindako bide nagusia (3D. irudia).Hori dela eta, MHC-I molekulen proteina-interakzioak gurutzatutako lagin guztietan konfiantza maila handiarekin aztertzera bideratu ginen.HLA α1, α2 eta α3 domeinuz eta kate arinez osatuta dago, eta mikroglobulina β2 (β2m) txaperona proteina konstantea da49.Erretikulu endoplasmatikoan bildu ondoren, HLA ezegonkorra da ligando peptidikorik ezean50.Peptidoekin lotzeko zirrikitua oso polimorfiko eta egituratu gabeko α1 eta α2 domeinuek osatzen dute, peptidoa ez den forman eta α351 domeinu nahiko polimorfiko txikiagoarekin.IFNα-ren presentzian, bi HLA-A konplexu detektatu ditugu: bata HMGA1 eta H2Brekin elkarreragina (5. irudia, S3 taula) eta bestea MDN1, LRCH4 eta H2Brekin (6. irudia).
IFNα-k HLA-A interakzio-sarea eragiten du H2B (H2BFS) eta HMGA1-ekin.(A) 2D grafikoa (SIM-XL softwarean sortutakoa) H2B-HLA-A-HMGA1 konplexuko elkarrekintza mota desberdinak irudikatzen dituena: interlink (urdina), interlink (gorria) eta lotura bakarra (beltza)..Identitate ezberdinetako domeinuak kolorez kodetuta daude32: H2B (histone; 2–102) eta MHC-I (MHC_1; 25–203, C1 taldea; 210–290 eta MHC_I_C; 337–364).Lotura gurutzatuaren atalasea 3,5ean ezarri zen.Puntu grafikoek HLA-A interakzio guneak H2B (B) eta HMGA1 (C)rekin adierazten dituzte, baita bi peptidoen arteko K edo S interakzio guneak ere.Irudian, lotura gurutzatuaren puntuazioaren atalasea 3.0-n ezartzen da.(D) PyMOL programako H2B, HLA-A eta HMGA1 proteinen egituretan agertzen diren proteinen arteko erlazioak.Egitura hauek Phyre2 zerbitzaria erabiliz modelatu ziren (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) eta H2B, HLA-A eta HMGA1 proteinen txantiloi-egiturak 1kx552, 1kj349 eta 2eze55 ziren, hurrenez hurren.
IFNα-k HLA-A interakzio-sarea eragiten du H2B (H2BFS), MDN1 eta LRCH4rekin.(A) Molekula barneko (gorria) eta molekulen arteko (urdina) lotura gurutzatuak 2Dko mapa interaktibo batean (SIM-XL softwarean sortutakoa) MDN1 zirkulu gisa irudikatuta.Lotura gurutzatuaren atalasea 3,5ean ezarri zen.Identitate desberdinetako domeinuak kolorez kodetuta daude32: H2B (histone; 2–102), MHC-I (MHC_1; 25–203, C1 taldea; 210–290 eta MHC_I_C; 337–364) eta LRCH4 (LRR_8 (68–126), LRR_8 (137–194) eta CH (535–641)).(B) PyMOL programako H2B, HLA-A, LRCH4 eta MDN1 proteinen egituretan agertzen diren proteinen arteko erlazioak.Egitura hauek Phyre2 zerbitzaria erabiliz modelatu ziren (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2) 1kx552, 1kj349, 6hlu62 eta 6i2665 txantiloi-egiturekin H2B, HLA-A, LRCH4 eta MDN1 proteinetarako, hurrenez hurren.HLA-A-rako H2B (C), LRCH4 (D) eta MDN1 (E) K edo S interakzio guneak erakusten dituzten puntu grafikoak.Lursailetarako, lotura gurutzatuaren puntuazioaren atalasea 3,0-n ezarri zen.
Genomaren osotasuna mantentzeaz gain, H2B histonak transkripzioaren erregulazioan ere parte hartzen du.H2B proteina histona domeinu zentral batez (HFD) osatzen dute, begiztekin bereizitako hiru α-helizez eta C-terminal isats batez osatua 41,52.H2Brekiko interakzio gehiena α1 helizean gertatzen da, eta horrek HFD heterodimeroarekin trimerizazioa ematen du (5A,B irudia).Lisinak DNAren loketan parte hartzen badute ere, lisina batzuk azetilazio edo metilazio gune alternatiboak ere badira.Adibidez, H2B-ko K43, K46 eta K57 hondakinek ez dute DNAren lotura zuzenean parte hartzen, baina transkripzio osteko hainbat aldaketaren xede dira53.Era berean, H2Bko K44, K47 eta K57 hondakinek rol alternatibo bat izan dezakete IFNα-ren presentzian, beste proteina batzuekiko elkarrekintzak barne (5A, B irudiak).Horrez gain, H2B histona kromosomikoak hainbat zelula-motetan erantzun immunea aktibatzen du, sentsore zitosoliko gisa jarduten du agente infekziosoetatik edo kaltetutako zeluletatik eratorritako DNA bikoitzeko (dsDNA) zatiak detektatzeko54.DNA birusen presentzian, H2B agortzeak IFN-β ekoizpena eta STAT154 fosforilazioa inhibitu zituen.H2B nukleoan sartu eta irteten da beste nukleoko histonak baino azkarrago mugitzen dela54.Tratatu gabeko lagin hautatuetan H2B interakzioak MDN1 eta LRCH4-rekin ere ikusi ziren.HLA-A-k H2Brekin elkarreragin zuela ikusi genuen IFNα-rekin tratatutako hiru laginetan eta tratatu gabeko lagin errepikatu batean.Datu hauek transkripzio-erregulaziotik independentea den funtzio fisiologiko alternatibo batean H2B-k duen eginkizuna islatzen dute.
HMGA1 (mugikortasun handiko AT-Hook 1 taldea), gaixotasunak sustatzen dituzten aminoazidoetan aberatsa den nukleoproteina txikia, HLA-Arekin batera identifikatu da.C-terminal buztana azidoa eta AT amu izeneko hiru DBD bereizi ditu, dsDNA55,56 AT-a aberats den eskualdeko zirrikitu txikira lotzen direlako.Lotura honek DNA tolestu edo zuzentzen du, transkripzio-faktore kanonikoak bere adostasun-sekuentziara sartzeko aukera emanez.C-terminaleko isatsak proteina-proteinen elkarrekintzetan eta transkripzio-faktoreen errekrutazioan parte hartzen duela uste da, C-terminaleko delezio mutanteek ezin baitute transkripzioa abiarazteko57.Gainera, domeinu honek kinasen substratu ezagunak diren hainbat fosforilazio gune kontserbatu ditu 58 .HLA-A eta H2B interakzioak ikusi ditugu HMGA1-ekin C-terminaleko domeinutik kanpo, C-terminaleko domeinua batez ere transkripzio-faktoreak lotzeko erabiltzen dela iradokiz (5A, C irudia).HMGA proteinak H1 histonarekin lehiatzen dira DNA egokitzailearekin lotzeko, eta horrela irisgarritasuna areagotzen du57.Era berean, badirudi HMGA-k H2B histonarekin elkarreragina izatea estekatzailearen DNAn zehar, H1 histonarekin lehian.HMGB1-ek HLA-A, -B eta -C-ren adierazpena eragiten du zelula dendritikoetan, eta horien aktibazioa eragiten du59, baina HMG eta HLAren arteko elkarrekintzarik ez da jakinarazi.HMGA1 HLA-A-ren α1 eta α3 domeinuekin elkarreragiten duela aurkitu dugu, bere 3 DBDtik kanpo dauden interakzio gehienak (5A, C irudia).Gure eskuetan, HLA-A nukleoan kokatuta zegoela aurkitu zen (datuak ez dira erakusten), eta H2B eta HMGA1 nukleoan ere badirela ikusita, interakzio hori ziurrenik nukleoan gertatzen da.H2B, HLA-A eta HMGA1 artean neurtutako aduktu espezifikoak 5D irudian ageri dira.
HLA-A-ren interakzio gehienak bere α1 eta α2 domeinuen eta C-terminal desordenatuaren domeinuaren barruan gertatzen dira (6. irudia).Adibide horietako batean, HLA-A-k LRCH4-ren N-terminal desordenatuarekin elkarreragiten duela ikusi dugu (6A,D irudia).LRCH4-k TLR4 aktibazioa eta LPS zitokinen indukzioa erregulatzen ditu, eta horrela berezko erantzun immunea modulatzen du60,61.Leuzina-aberastutako bederatzi errepikapen (LRR) eta bere ektodomeinuan kalmodulinaren (CH) homologia motibo dituen mintz-proteina bat da, eta ondoren transmintz-domeinua (TMD) 60, 62 .CH domeinuek proteina-proteinen arteko elkarreraginak bideratzen dituztela jakinarazi dute 60 .LRR eta CH domeinuen artean 300 aminoazido inguruko tarte bat nahiko eskuragarria da baina desordenatuta dago.Desordenatutako eskualdeek proteina-proteina sareen bitartekari gisa eta garraio besikularraren 63 funtzioan oinarrituta, proteina-interakzio gehienak eskualde desordenatuetan gertatzen direla ikusi dugu.MDN1-ekin elkarrekintzak proteinaren luzeran zehar banatu ziren, LRR1, LRR6, CH domeinuak eta ausazko eskualdeak barne, H2B batez ere CH domeinura lotzen zen bitartean (6A, B irudia).Nabarmentzekoa, elkarrekintza batek ere ez zuen TMJ-a sartu, CLMS ikuspegiaren berezitasuna iradokiz (6A, B irudia).
MDN1 HLA-A proteina sarearen parte gisa ere identifikatu da (6A irudia).AAA proteina familiakoa da (jarduera ezberdinekin lotutako ATPasak).Hau N-terminaleko AAA domeinu bera da, eraztun hexameriko batean antolatzen dena eta 60S 64 erribosomiko azpiunitatetik muntatze-faktorea kentzen duena.dynein64,65,66 antzekoa dirudi.Horrez gain, Asp/Glu eskualde aberatsa MIDAS domeinua jarraitzen du (ioi metalikoen menpeko gunea).MDN1en tamaina handia (5600 aminoazido gutxi gorabehera) eta ongi aztertutako proteinekin duen homologia mugatua dela eta, ezer gutxi dakigu gizakiengan duen egitura eta funtzioaz.HLA-A, H2B eta LRCH4 MDN1 lotze-kide gisa identifikatu genituen eta PyMol-en proteina-konplexu gisa duten orientazioa agerian utzi genuen (6A, B irudiak).Hiru proteina hauek AAA domeinuarekin, dineina antzeko estekatzaile-domeinuarekin eta, agian, MIDAS MDN1 domeinuarekin, elkarreragiten dute.Aurreko txosten batean, bait-proteinen afinitate-arazteak MDN1 H2B67 histonarekin lotutako proteina gisa identifikatu zuen.Horrez gain, azken ikerketa batek HCT116 zeluletan MDN eta HLA-B-ren arteko elkarrekintza ere jakinarazi zuen afinitate-araztutako masa-espektrometria erabiliz, gure aurkikuntzak onartzen dituena68.IFNα-rekin tratatutako laginetan konplexu hau identifikatzeak MDN1-ek interferoiaren seinaleztapenean duen zeregina iradokitzen du.
HLA geneak oso polimorfoak direnez, Flo-1 zelulen RNA sekuentziazio datuetatik HLA-A, -B eta -C mapatzen duten sekuentziazio irakurketak atera ditugu (datuak ez dira erakusten).Sekuentziazio-irakurketarekin bat datozen peptido-sekuentziak HLA-A, -B eta -C-ren arteko desberdintasun esanguratsuak agerian utzi zituzten gurutzatutako peptidoak HLA-An kokatuta zeuden eskualdeetan (S3 irudia).Horrez gain, ez dugu ikusi HLA-B/C molekulen proteina eta proteina arteko gurutzaketa H2B/HMGA1/MDN1/LRCH4 proteinekin.Horrek iradokitzen du HLA-A, MDN1, LRCH1 eta HMGA1 artean aurkitutako proteina-interakzioa HLA-A espezifikoa dela.Gainera, gurutzatuta ez dauden laginen analisi proteomikoak (S4 taula) erakutsi zuen HLA-Ak sekuentzia-estaldura handiagoa duela HLA-B edo HLA-Crekin alderatuta.HLA-A-rako identifikatutako peptidoek intentsitate handia zuten bai IFNα-rekin tratatutako laginetan, bai tratatu gabeko laginetan.
Hemen identifikatutako elkarrekintzak espazio hurbileko bi proteinen gurutzaketa ez-espezifikoaren ondoriozkoak ez zirela ziurtatzeko, HLA-A elkarreraginean dauden bi faktore berri baieztatu genituen ko-immunoprezipitazioaren saiakuntzak eginez.HLA-A MDN1 eta H2B endogenoekiko elkarrekintzak detektatu ziren bai IFNα-rekin tratatutako bai tratatu gabeko Flo-1 zeluletan (7. irudia, S4 irudia).HLA-A immunoprecipitatesetan H2B-k harrapatu zuela baieztatu genuen eta asoziazio hori IFNα tratamenduari zor zaiola HLA-A ez zegoen tratatu gabeko zeluletako immunoprecipitate laginetan (7A irudia).Hala ere, gure datuek iradokitzen dute IFNα modu desberdinean erregulatzen duela HLA-A H2B eta MDN1ekiko lotura.IFNα-k H2B eta HLA-A-ren arteko asoziazioa eragiten du, baina MDN1arekin duen lotura murrizten du.Kontroletan MDN1 HLA-Arekin lotuta zegoela ikusi genuen, eta IFNα gehitzeak MDN1 indukziotik independentea den elkarrekintza murriztu zuen IFNα-ren bidez (7B, C irudia).Horrez gain, HLA-A immunoprezipitazioak H2B harrapatu zuen A549 zeluletan (S4. irud.), elkarrekintza hori zelula motatik independentea dela iradokiz.Batera hartuta, emaitza hauek HLA-A-ren interferoi bidezko interakzioak onartzen dituzte H2B eta MDN1-ekin.
HLA-Ak H2B eta MDN1 batera arazten ditu.H2B (A) eta MDN1 (B) immunoblots endogeno adierazgarriak IFNα-rekin tratatutako Flo-1 zeluletatik immunoprecipitated eta adierazitako antigorputzak probatu ziren.Saguaren eta untxiaren IgG kontrol negatibo gisa erabili ziren.(C) Antigeno desberdinen kantitate erlatiboak (sarrera) adierazitako antigorputzen aurka zundatutako immunoblotsen bidez irudikatzen dira, β-aktina karga-kontrol gisa erabili zen.
H2B-HLA-A-HMGA1 interferoiak eragindako sare gurutzatuen fidagarritasun handiko baten egiturazko propietateak ikertu ziren.Konplexu honetan parte hartzen duten proteinen konformazio-dinamika ulertzeko ikuspegi alternatibo gisa dinamika molekularren modelizazioa erabili dugu (8. Irudia).CLMS datuen inferentziak H2B, HLA-A eta HMGA1 proteinen konformazio desberdinak izateko aukera iradokitzen du.Hori dela eta, honako konplexu potentzial hauek disolbatzaile-medio batean modelatu ziren: H2B-HLA-A, HMGA1-HLA-A eta H2B-HLA-A-HMGA1.MOE (Molecular Operating Environment; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) paketearen hasierako proteina-proteinen atrakatze-pantaila batek proteina horien artean desberdinak diren konformazio posibleak iradoki zituen (8A. irudia).Docking proteina konplexuaren bistaratzeak hainbat interakzio eta konformazio posibleak agerian utzi zituen (5A, 8. Irudia).Horrela, 8A irudian konformazio posible bat agertzen da (etiquetadun lotura gurutzatuekin) eta gehiago ebaluatu zen MD modelatzeko kanalizazioa erabiliz.Gainera, H2B edo HMGA1 HLA-A-rekin lotzeak H2B-k HLA-A-rekin duen afinitate handiagoa nabarmentzen du (8A. irudia).
H2B (H2BFS)-HLA-A, HMGA1-HLA-A eta H2B-HLA-A-HMGA1 konplexuen arteko sare posibleen konformazio-dinamika.(A) Ezkerreko panela 2D mapa bat da (SIM-XL softwarean sortutakoa) molekula barneko (gorria) eta molekulen arteko (urdina) lotura gurutzatuen (gurutze-ebakidura 3.5ean ezarrita).Gainera, identifikatutako gurutzadura-hondarrak H2B, HLA-A eta HMGA1 proteinen egituretan etiketatzen dira.Proteina hauen konformazio elkartuak MOE paketean inplementatutako docking pipeline erabiliz atera ziren.Beheko ezkerreko panelak H2B-HLA-A eta HMGA1-HLA-A konplexuen konformazio posible desberdinak erakusten ditu proteina eta proteina lotzeko afinitate ezberdinekin (GBVI/WSA dG; kcal/mol).(B) Proteina-egitura bakoitzeko posizio atomikoen (hidrogeno-atomoak izan ezik) desbideratze estandarra (RMSD).(C) Proteina-proteinen hidrogeno-lotura intermolekularraren arteko elkarrekintzak simulatutako hainbat konplexuren iraupen espezifikoak kontuan hartuta ≥ 10 ns.h-lotura emaile-onartzaile-mozketaren distantzia 3,5 Å-n ezarri zen eta emaile-H-onartzailearen mozketa angelua ≥ 160°-180°-n ezarri zen.(D) HLA-A proteina-protein elkarreraginak sortzen dituzten etiketatutako hondakinak, ≥ 20 ns-koak, HLA-A-H2B eta HLA-A-HMGA1 konplexu finkoetatik ateratakoak.Proteinen egiturek 100 ns-ko MDS batez besteko egitura adierazten dute.(E) HLA-A-H2B eta HLA-A-HMGA1 konplexuen arteko elkarrekintzak 100 ns baino gehiago H2B-HLA simulazioaren bidez jarraitutako elkarreraginekin alderatuta, bi peptidoen arteko K edo S interakzio gunean oinarrituta.Konplexuak /HMGA1-HLA-A/H2B-HLA-A-HMGA1.Lotura gurutzatuak ebaluatzeko atalase-balioa 3.0-n ezarri zen, eta ≥ 10 ns hartuz MDS-ren interakzio espezifikoak hartu ziren kontuan.Proteinen egiturak BIOVIA Discovery Studio (Dassault Systèmes, BIOVIA Corp., San Diego, CA, AEB) eta Molecular Operating Environment (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) paketeen bidez bistaratu ziren.
HLA-A molekulen egonkortasunak denboran zehar (desbideratze estandarra; RMSD edo desbideratze estandarra; RMSF) adierazi zuen konplexuetan H2B edo HMGA1 proteinak egoteak HLA-A egonkortu zuela (8B irudia, S5 irudia).HMGA1 proteina HLA-A-ren B2M gunera estu lotzen da, HLA-A-A aminoazidoen egonkortasuna HLA-A-HMGA1 edo H2B-HLA-A-HMGA1 konplexuan (8B irudia, S5 irudia).bereziki, HLA hondarrak ~ 60-90 eta ~ 180-210 malgu gutxiago zirela aurkitu zen H2Bren aurrean (8B. IRUDIA).H2B eta HMGA1-ek HLA-A-rekin lotura hobea erakutsi zuten H2B-HLA-A-HMGA1 konplexuan HLA-A H2B-rekin edo HMGA1-ekin bakarrik lotzearen aldean (8C, D irudia; S5 taula).Hidrogeno-loturan parte hartzen duten hondakinak (MD modeled high occupancy ≥ 10 ns) bat datoz CLMS interakzio guneekin (K edo S hondarrak) konplexuan, eta horrek CLMS-k identifikatutako elkarrekintzak oso fidagarriak direla iradokitzen du.Fidagarritasuna (8E. irudia).CLMS eta MD modelizazioan, 190-210 eta 200-220 aminoazido inguru arteko HLA-A hondakinek H2B eta HMGA1 lotzen zituzten, hurrenez hurren (8E IRUDIA).
Proteina-proteina elkarrekintzak egitura-sare dinamikoak eratzen dituzte, estimulu jakin batzuei erantzunez zelula barneko komunikazioa bideratzen dutenak.Proteomikaren ikuspegi askok proteina baten egoera egonkorreko maila orokorrean aldaketak hautematen dituenez, proteina-proteinen elkarrekintza dinamikak tresna osagarriak behar ditu lotura-interfazeak harrapatzeko, eta CLMS da tresna horietako bat.Interferonaren seinaleztapen-sistema zitokina-sare bat da, zelulek ingurumen-seinale patogeno eta intrintseko patologiko batzuei erantzuteko aukera ematen diena, interferoiak induzi daitezkeen proteinen azpimultzoen indukzioan amaitzen dena.CLMS aplikatu genuen interferoiak eragindako proteinen panel baten artean proteina-proteina interakzio berriak identifikatu zitezkeen zehazteko.Proteinen gurutzaketa globalaren analisia interferoiari erantzuteko Flo-1 zelula eredu batean erabili zen proteina konplexuak harrapatzeko.Gurutzatu gabeko eta gurutzatutako zeluletatik peptido triptikoen erauzketak peptidoen zenbaketa, bideen aberastea eta peptidoen luzera banatzea ahalbidetzen du LFQ intentsitate definituarekin.Interferoiaren bidez induzitzen diren proteina kanonikoak barne-kontrol positibo gisa identifikatu ziren, eta interferoi bidez induzitzen diren proteina kanonikoen gurutzatutako aduktu intermolekular eta intramolekular berriak ikusi ziren, hala nola MX1, UP18, OAS3 eta STAT1.Eremu funtzionaletako hainbat ezaugarri estruktural eta elkarrekintza ikertu dira.
HLA-A, MDN1 eta H2B-ren arteko elkarrekintza detektatu zen immunoblotting bidez IFNα-rekin tratatu eta tratatu gabeko Flo-1 eta A549 zeluletan.Gure emaitzek nabarmentzen dute HLA-A konplexua H2Brekin IFNα-ren menpeko moduan.Gure lanak bi konplexu hauen ko-lokalizazioa sakonago aztertzeko bide interesgarria da.Interesgarria izango litzateke, halaber, CLMS ikuspegia zelula-lerroen panel batera zabaltzea zelula-mota independentea den interferoi bidezko proteina-interakzioak identifikatzeko.Azkenik, H2BFS-HLA-A-HMGA1 konplexuan parte hartzen duten proteinen konformazio-dinamika ulertzeko ikuspegi alternatibo gisa MD modelizazioa erabili dugu, zeinak molekula barneko eta molekularteko gurutzaketak jarraitzen zituen.CLMS datuen inferentziak H2BFS, HLA-A eta HMGA1 proteinen konformazio desberdinak izateko aukera iradokitzen du.Docking proteina-konplexu horien arteko konformazio ezberdin posibleek CLMS datu-multzoan ikusitakoen antzeko hainbat interakzio agerian utzi zituzten.Gure metodoaren indargune nagusietako bat HLA bezalako gene oso polimorfikoak erraz identifikatzea ahalbidetzen duela da, eta, beraz, interesgarria izango da aztertzen zailak diren HLA haplotipoaren berariazko proteinen elkarrekintzak aztertzea.Batera hartuta, gure datuek frogatzen dute CLMS erabil daitekeela interferoiak eragindako seinaleztapen-sareen ulermena zabaltzeko eta tumoreen mikroingurunean zelula arteko sistema konplexuagoak aztertzeko oinarria emateko.
Flo-1 zelulak ATCCtik lortu eta DMEM-n (Gibco) mantendu ziren %1 penizilina/estreptomizina (Invitrogen), %10 fetal behi-serumarekin (Gibco) eta 37 °C-tan eta %5 CO2-an gorde.Inkubazioa.Zelulak % 70-80ko konfluentzian hazi ziren IFNα14-rekin tratatu aurretik (Edinburgh Protein Production Facility-k fabrikatua).Beste produktu kimiko eta erreaktibo guztiak Sigma Aldrich-i erosi zizkion, bestela adierazi ezean.
Flo-1 zelulak 6 putzuko plaketan hazi ziren eta hurrengo egunean zelulak 10 ng/ml IFNα14rekin tratatu ziren 24 orduz, gutxi gorabehera %80ko konfluentzia arte.Zelulak hiru aldiz garbitu ziren PBSarekin eta DSS (Thermo Fisher Scientific) berriki prestatuarekin (DMSOn disolbatuta) PBSn ligatu ziren 5 minutuz 37° C-tan, 0,5 mM-ko azken kontzentrazioraino.DSS gurutzatze-erreakzioa PBSrekin ordezkatu zen eta hondar DSS itzali egin zen 20 mM Tris (pH 8.0) PBSn 15 minutuz 37 °C-tan gehituz.Zelulak scraping bidez bildu eta lotura baxuko hodietan bildu ziren (Axygen).
Zelula pelleta 300 µl urearen lisi bufferrekin (8 M urea, 0,1 M Tris, pH 8,5) lisatu zen 30 minutuz giro-tenperaturan noizean behin astinduz.Zentrifugazio-pauso guztiak 14.000 xg-tan egin ziren 8 °C-tan.Lisatua zentrifugatu 10 minutuz eta gainnadantea hodi berri batera transferitu.Gainerako partikula argiak bigarren lisi-tamponaren 150 μl-tan disolbatu ziren (2 M urea, % 2 (w/v) SDS (sodio dodecil sulfatoa)) 30 minutuz edo gehiagoz, ur-disoluzio homogeneo bat lortu arte.Lisatua 20 minutuz zentrifugatu eta gainnatzailea aurreko urratsean lortutako lisatuarekin nahastu zen.Proteinen kontzentrazioa Micro BCA saiakera erabiliz ebaluatu ziren (Thermo Fisher Scientific) mikroplaken prozedurei buruzko fabrikatzailearen jarraibideen arabera.Laginak azkar izoztu ziren nitrogeno likidoan eta -80 °C-tan gorde ziren.
Gutxi gorabehera 100 μg gurutzatutako proteina disolbagarri prozesatu ziren filtrazio-laginak prestatzeko protokolo aldatu (FASP) erabiliz Wisniewski et al-ek deskribatutako moduan.69 Laburbilduz, proteina 200 µl urea bufferrekin (8 M urea 0,1 M Tris, pH 8,5) gurutzatzen da, zurrunbiloarekin eta erdira zatituta.Zentrifugazio-pauso guztiak 14.000 xg-tan egin ziren 25 °C-tan.Gurutzatutako proteina lisatuaren lehen erdia Ultracel-10 mintz batekin (Merck) hornitutako 10 kDa Microcon iragazki zentrifugoko gailu batera transferitu zen, eta ondoren iragazkia zentrifugatzen zen 25 minutuz.Ondoren, gehitu proteinaren bigarren erdia iragazkia eta errepikatu urrats berdinak.Proteinen berreskurapena 17 mM tris(2-karboxietil)fosfina klorhidrato (TCEP) 100 μl gehituz egin zen urea tamponean.Berreskuratzea termonahastailean irabiatu zen 600 rpm-an 30 minutuz 37 °C-tan.Horrez gain, zutabea zentrifugatu eta gurutzatutako proteina murriztua alkilatu zen 50 mM iodoacetamida 100 μl erabiliz urea tamponean.Alkilazio-erreakzioa giro-tenperaturan egin zen ilunpetan 20 minutuz.Biratu zutabea, garbitu zutabeen hormak 3 aldiz 100 µl urea tamponarekin eta, ondoren, zentrifugatu.Eragiketa bera 3 aldiz egin zen 100 mM amonio bikarbonatoko 100 μl erabiliz.Tripsinizazioa baino lehen, ordeztu bilketa-hodia berri batekin.Gehitu 50 mM amonio bikarbonato eta 1 µl tripsina tripsina tamponean (Promega) diluitutako digestio-bufferra.Tripsinaren eta proteinaren arteko proportzioa 1:33 inguruan mantendu zen, eta digestio-erreakzioak gau osoan inkubatu ziren 37° C-tan ganbera heze batean.Gurutzatutako peptidoa iragazkitik atera zen zentrifugazioaren bidez 25 minutuz.Peptidoen berreskurapena hobetu zen iragazkia 0,5 M NaCl 50 μl gehituz, eta ondoren zentrifugazioa egin zen 25 minutuz.
C18 Micro Spin zutabeak (Harvard Apparatus) gurutzatutako peptido triptikoen gatzgabetzeko erabili ziren Bouchal et al.70-k deskribatutako protokoloari aldaketa txikiekin.Laburbilduz, C18 spin-zutabeak %0,1eko azido formikoko (FA) hiru garbiketarekin azetonitriloan (AcN) (Merck) eta %0,1eko FAko bi garbiketarekin aktibatu ziren.Zutabea % 0,1 FArekin hidratatu zen 15 minutuz.Kargatu laginak spin zutabeetan eta garbitu 3 aldiz % 0,1 FArekin.Gatz gabeko peptidoak sekuentzialki eluatu ziren gradiente mailakatu batekin % 50, % 80 eta % 100 AcN % 0,1 FAn erabiliz.Laginak SpeedVac Plus kontzentratzaile batean (Eppendorf) lehortu ziren, hondar likidoa guztiz desagertu arte.Elututako peptidoak % 0,08ko azido trifluoroacetikoko 100 μltan disolbatu ziren % 2,5eko AcNn eta kontzentrazioak NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) batean neurtu ziren.Lagin bakoitzeko 1 μg gurutzatutako peptido gutxi gorabehera injektatu zen LC-MS/MS sisteman.
Gurutzatutako peptidoak UltiMate 3000 RSLCnano LC sistema batean (Thermo Scientific) bereizi ziren Orbitrap Exploris 480 masa espektrometroarekin (Thermo Scientific) konektatuta.Gurutzatutako peptidoak 300 µm ID, 5 mm luzeko µ-aurreko zutabearen C18 harrapatzeko zutabe batean bildu ziren C18 PepMap100 sorbentarekin eta 5 µm PepMap sorbentarekin (Thermo Scientific) josia.Kargatu 5 µl/min 0,08% azido trifluoroacetic disolbatutako ponparen emaria 2,5% AcNtan.Gurutzatutako peptidoak 75 μm-ko barruko diametroa eta 150 mm-ko luzera duen silize fusionatutako zutabe analitiko batean bereizi ziren, 2 μm PepMap sorbent batekin (Thermo Scientific) beteta.A eta B fase mugikorrak uretan % 0,1 FA eta azetonitriloan % 0,1 FAz osatuta zeuden, hurrenez hurren.Gradientea B % 2,5ean hasten da eta linealki handitzen da B % 40ra arte 90 minututan, eta hurrengo 2 minututan B % 90era arte.Fase mugikorren konposizioa % 90 B-an mantendu zen 10 minutuz eta, ondoren, linealki jaitsi zen % 2,5 B-ra 2 minututan.Zutabea % 2,5 B-tan orekatu zen hurrengo zikloa baino 8 minutuz.Zutabe analitikotik ateratako gurutzatutako peptidoak ionizatu ziren nanoelektroespray ionizazio-iturri batean (NSI) eta Exploris 480 masa-espektrometro batean injektatu ziren (Thermo Scientific).
Orbitrap Exploris 480 masa espektrometroak datuen korrelazio modu positiboan funtzionatzen zuen.Eskaneatu osoa sekzio moduan egin zen 120.000 bereizmenarekin m/z 350 Th-tik m/z 2000 Th-ra bitarteko ezarpenekin.AGC normalizatuaren helburua % 300ean ezarri zen 50 ms-ko gehienezko sarrera-denborarekin.Peptidoentzako gailur monoisotopikoak detektatzea ezarri da.Murrizketa erlaxazio-parametroa egia gisa ezartzen da aitzindari gutxiegi aurkitzen badira.Aitzindariaren gutxieneko indar ionikoa 5.0e3-n ezarri zen eta aitzindariaren karga-egoerak +8ra arteko esperimentuetan sartu ziren.
Datuen korrelazio moduan azterketa nagusien arteko ziklo-denbora 2,5 segundotan ezarri zen.Masa-esklusio dinamikoa ioi aitzindariaren lehen zatiketaren ondoren 20 s-ra ezarri zen.Aurrekarien isolamendu-leihoa 2 Th-an ezarri zen.Talka-energia normalizatua talka-energia modu finkoarekin datuen araberako MS/MS eskaneatu batean aukeratu zen.Talkaren energia %30ean ezarri da.Orbitrap bereizmena 15.000ean ezarri zen eta AGC helburua % 100ean.Gehienezko injekzio denbora pertsonalizatua 60 milisegundotan ezarri da.
Proteina-proteina sarea gurutzatutako laginetan jarraitu aurretik, fitxategi gordinak prozesatu ditugu MaxQuant paketearen bidez (1.6.12.0 bertsioa)26,27 laginetako peptido/proteinak trazagarriak identifikatzeko.Horrez gain, IFNα-rekin tratatu eta tratatu gabeko Flo-1 lagin gurutzatugabeetan antzeko analisi proteomikoak egin ziren.MS/MS datuak UniProt giza datu-basean (www.uniprot.org) bilatu ziren (2020ko abuztuaren 12an kargatuta, 75.093 sarrera ditu) Andromeda27 bilatzaile integratua erabiliz.Bilaketa entzimaren espezifikotasuna eta desamidazioaren (N, Q) eta oxidazioaren (M) hainbat aldaketa adierazi gabe egin da.Aurrekarien masa-perdoiak 20 ppm-an ezarri ziren eta produktu ioiak 0,02 Da-n.Hasierako eta gehieneko masa desbideratzea 10 ppm-ra ezarri zen.Peptidoaren masa maximoa 4600 Da-n ezarri zen eta sekuentziaren antzekotasuna 7 eta 25 aminoazido (aa) artean ezarri zen.Analisi estatistiko gehiago Perseus programa erabiliz (1.6.10.45 bertsioa).Proteinaren edukia proteinaren intentsitate espektrala normalizatuz (LFQ intentsitatea; etiketarik gabeko kuantifikazioa)27 eta intentsitate-balioak Log2-ra bihurtu ziren.Bere peptido-intentsitatearen arabera identifikatutako proteinen multzo hierarkikoa eraiki zen R-ko pheatmap (v1.0.12) paketea erabiliz (v 4.1.2).Ibilbideen aberastearen analisia tratatu gabeko laginekin alderatuta lau aldiz baino gehiago aktibatu ziren IFNα-rekin tratatutako proteinen Reactome bide datu-basea erabiliz egin da.
LC-MS/MS bidez monitorizatutako proteina-konplexuen lisina (K) edo serina (S) lotura kimiko espezifikoak identifikatzea gurutzatutako peptidoetarako (SIM-XL) identifikazio espektroskopikoko makina (SIM-XL) erabiliz egin da29.Lehenik eta behin, interferoiarekin lotutako (IFN) DNAren kalte-erresistentzia sinaduraren (IRDS) geneen arteko interakzio posibleak ikertu ziren Padariya et al.28-n deskribatutako IRDS proteinaren datu-multzoa erabiliz.Giza UniProt osoaren baldintza eta errepikapen guztiak aztertzea konputazionalki intentsiboa da, beraz, giza UniProt datu-base osoa (www.uniprot.org) (2020ko abuztuaren 12an deskargatua, 75.093 sarrera ditu) IFNα-rekin tratatutako errepikapenen aurka.Konfiantza handiko interakzioetarako iragazkietako bat.Lortutako esangura handiko elkarrekintza hauek errepikapen eta baldintza guztietan zabaldu eta probatu ziren.
SIM-XL-n, DSS gurutzatzeko (XL) erabili zen eta XL pisu-aldaketa eta aldaketa-pisu-aldaketa 138.06 eta 156.07-n ezarri ziren, hurrenez hurren.Ondoko lotura-erreakzio-guneak hartzen dira kontuan: KK, KS eta KN-TERM, ioi berritzailerik gabe.Bai aitzindaria eta bai fragmentua ppm 20ean ezarri ziren eta Xrea atalasea 0,15ean ezarri zen.Tripsina guztiz espezifikotzat hartu zen, eta energia handiko C-tranpa (HCD) zatikatzeko metodo bat ezarri zen.XCorr DB dinamikoaren murrizketa atalasea eta DB dinamikoaren murrizketarako gutxieneko peptido kopurua 2,5 eta 2 izan dira, hurrenez hurren.Beste parametro batzuk hauek dira: probabilitatea monoisotopoa eta kointzidentzia-ebakidura gailurra, gutxienez 4 AA hondar kate bakoitzeko eta gehienezko hariaren karga, eta galdutako zatiketen 3 maximo.Ondorioz jositako 2D mapak (SIM-XL) aztertu ziren eta xQuest28 irudikapen grafikoa erabili zen 2D mapak eraikitzeko.Proteinen egituretako proteinen loturak PyMol-en eskaintzen dira (PyMOL Molecular Graphics System, 2.0 bertsioa Schrödinger, LLC).
Proteina-ereduen egiturak Phyre2 zerbitzaria erabiliz (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)11 sortu ziren, "Hidden Markov Method"-aren homologia modelatzearen eta inplementazioaren printzipioak erabiliz.Phyre2-k eredu-egiturak sortzen ditu proteina-egitura ezagunekin sekuentzia lerrokatzean oinarrituta.H2BFS, HLA-A, HMGA1, LRCH4 eta MDN1 proteinetarako, 1kx552, 1kj349, 2eze55, 6hlu62 eta 6i2665 txantiloi-egiturak erabili ziren.Horrez gain, AlphaFold71 MX1, UBP18 eta ROBO1-en egitura ere kontuan hartu zen.Proteinaren egitura BIOVIA Discovery Studio Visualizer paketea (Dassault Systèmes, BIOVIA, San Diego, CA, AEB) eta Molecular Operating Environment paketea (MOE; Chemical Computing Group Inc., Montreal, Quebec, Kanada) erabiliz bistaratu da.