ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Industria Kimikoko osagai kimikorako Soldatutako Hodi Duplexa, SPECC1L-ren gabeziak junturak junturak egonkortasuna areagotzea eta garezurreko gandorra zelulak isurtzea murrizten du.

Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.CSS laguntza mugatua duen arakatzailearen bertsioa erabiltzen ari zara.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Horrez gain, etengabeko laguntza bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe erakusten dugu.

ASTM A790 2507 / 2205 1.4462 / 1.4410 Duplex Hodi Soldatuak Industria Kimikorako

Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.altzairu herdoilgaitzezko hodietan espezializatutako fabrikatzaile nagusia da, hodi errekozitu distiratsuetan, josturarik gabeko hodi harilkatuetan etab.Bezeroei erraztasunak emateko, hodiak eta hodiak ere soldatu ditugu.Liaocheng Sihe SS Material Co., Ltd.ekoizteko eta probatzeko ekiporik aurreratuenak ditu.Zure eskakizuna guztiz ase dezakegu.Estandar oso zorrotzaren arabera, guk ekoitzitako hodiek OD eta WT tolerantzia zuzena dute beti.Tolerantzia-kontrola zorrozki bat dator estandarrak ekoizteko.Gure produktuak beti bezeroekin pozik daude.Gure produktuak erosi zituzten bezeroek irabazi gehiago sortu zituzten.
a) OD (kanpoko diametroa): 3,18 mm-tik 101,6 mm-ra
b) WT (hormaren lodiera): 0,5 mm-tik 20 mm-ra
c) Luzera: bezeroaren eskakizunaren arabera
d) Arauak: ASTM A312;ASTM A269;ASTM A789;ASTM A790 etab
e) Prozesuaren metodoa: ERW, EFW etab

Diapositiba bakoitzeko hiru artikulu erakusten dituzten graduatzaileak.Erabili atzeko eta hurrengo botoiak diapositibetan zehar mugitzeko, edo amaierako diapositiba kontroladorearen botoiak diapositiba bakoitzean mugitzeko.
Garezurreko gandorra neuronalaren zelulak (CNCC) enbrioi-tolestura neuraletatik atera eta faringe-arkuetara migratzen dira, aurpegi erdiko egitura gehienak osatzen dituztenak.CNCC disfuntzioak paper garrantzitsua betetzen du orofacial-arrailduraren etiologian, sortzetiko malformazio ohikoa dena.SPECC1L mutazio heterozigotikoak aurkitu dira zirrikitu atipikoak eta sindromikoak dituzten pazienteetan.Hemen, itsasgarri itsasgarri kanonikoen (AJ) osagaien, β-katenina eta E-kadherinaren tindaketa hobetuaren berri ematen dugu SPECC1L knockdown zeluletan, eta mikrografi elektronikoek AJren difusio apikal-basala erakusten dute.SPECC1L-k kraneo-aurpegiaren morfogenesian duen papera ulertzeko, Specc1l eskasaren saguaren eredua sortu dugu.Mutante homozigotoak enbrioi hilgarriak dira eta hodi neuralaren itxiera eta CNCC laminazio kaltetuak dituzte.AJ proteinaren tindaketa areagotu egiten da tolestu neuronal mutanteetan.AJ akats hau CNCC delaminazioaren akats batekin bat dator, AJ desegitea eskatzen duena.Gainera, Specc11 mutanteek PI3K-AKT seinaleztapena murriztu dute eta apoptosia areagotu dute.In vitro, zelula basatietan PI3K-AKT seinaleztapenaren inhibizio arina nahikoa zen AJ aldaketak eragiteko.Garrantzitsua da, SPECC1L kolpeak eragindako AJ aldaketak PI3K-AKT bidearen aktibazioan alderantzikatu daitezke.Batera hartuta, datu hauek iradokitzen dute SPECC1L, PI3K-AKT seinaleztapenaren eta AJ biologiaren erregulatzaile berri gisa, hodi neuralak ixteko eta CNCC estratifikaziorako beharrezkoa dela.
Garezurreko gandorraren zelulak (CNCC) neuroektodermo dortsalean kokatzen dira eta garatzen ari diren tolestura neuronalen neuroepiteliotik askatzen dira epitelio-mesenkimal trantsizio (EMT) prozesu baten bidez1,2,3.Migrazio aurreko CNCC epitelialek zelulen arteko loturak apurtzen dituzte eta lehen eta bigarren arku faringeoa betetzen duten eta kranio-aurpegiko kartilago gehiena osatzen duten CNCC mesenkimal migratzaileak bihurtzen dira.Horrela, CNCC funtzioa erregulatzen duten geneak askotan eten egiten dira kraneo-aurpegiko sortzetiko anomalien etiologian, hala nola orofacial-arraildurak, gehienetan AEBetan soilik 1/800 jaiotza eragiten dutenak.Sortzetiko deformazioetako bat8.
CNCC-ren delaminazioa saguetan enbrioi-garapeneko 8,5 eta 9,5 egunen artean aurreko hodi neuralaren itxierarekin bat dator.Saguaren orofacial-arraildurarekin lotutako gene batzuen mutanteek ere hodi neuralaren akatsen bat erakusten dute, Irf69,10, Ghrl310, Cfl111 eta Pdgfrα12 barne.Hala ere, hodi neuralaren itxieraren eta CNCC estratifikazioaren prozesuak independentetzat har daitezke, Splotch sagu mutanteak (Pax3) hodi neuralaren itxieran akatsak baititu CNCC estratifikazioan edo migrazioan inolako eraginik gabe 13,14.CNCC disekzioan eta hodi neuralaren itxieran akatsak dituzten sagu-eredu osagarriek bi prozesu hauen oinarri molekular komuna zehazten lagunduko dute.
CNCC zelula neuroepitelialetatik isolatzeak itsasgarri-junturak (AJ) disolbatzea eskatzen du, besteak beste, E-kadherina, β-katenina, α-E-katenina eta aktina harizpiekin lotutako α-aktinina dituzten proteina-konplexuez osatuta daudenak. Gainespresio-azterketek E-kadherinak tolestura neuronaletan erakutsi zuten CNCC delaminazioaren murrizketa edo atzerapena.Aitzitik, E-kadherinaren kentzeak estratifikazio goiztiarra eragiten du15,16.CNCC estratifikazioan EMT bitartekaria duten faktore asko transkripzio-faktoreak dira (AP2α, Id2, FOXD3, SAIL, TWIST, SOX10) eta matrizeaz kanpoko matrizea (ECM) birmoldatzeko proteinak, hala nola matrize metaloproteinasak (MMPak), hala ere CNCCk AJ zitoeskeletiko zuzeneko erregulatzaileak dira. oraindik ezezaguna.Jakina da PI3K-AKT bideak E-kadherina-mailak antagonizatzen dituela, batez ere minbiziaren ikerketatik17.Azken ikerketek frogatu dute saguetan PDGFα-n oinarritutako PI3K-AKT seinaleztapena galtzeak garezurreko anomaliak ekartzen dituela, ahosabaia eta hodi neuralaren akatsak barne12.Hala ere, ez dago argi PI3K-AKT bidearen eta AJ egonkortasunaren arteko erlazioa CNCC estratifikazioaren gainean.
Aurretik SPECC1L lehen gene mutantea bezala identifikatu genuen ahotik begiraino hedatzen den pitzadura larria duten bi pertsonengan, zeihar-arraildura (ObFC) edo Tessier IV18 arraildura gisa ezagutzen dena.SPECC1L mutazioak Opitz G/BBB sindromea duten belaunaldi anitzeko bi familiatan identifikatu dira (OMIM #145410), zeinetan kaltetutako gizabanakoek hiperdistantzia eta ezpain/ahosabaia zirrikitu zuten19, eta Tibi gehiegizko distantzia sindromea duten familia batean (OMIM #145420)20. .Opitz G/BBB sindromearen kasuen erdia baino gehiago X-ra lotuta daude (OMIM #300000) eta mikrotubuluei lotutako zelula-eskeletoaren 22 proteina kodetzen duen MID1 genearen mutazioek eragindakoak dira.Hipotesi egiten dugu SPECC1L, mikrotubuluekin eta aktina-zitoeskeletoarekin lotutako proteina bat ere, aktina-zitoeskeletoa birmoldatzeko beharrezkoa den seinaleztapena bideratu dezakeela zelulen atxikimenduan eta migrazioan 18 .In vitro eta in vivo ikerketen bidez, orain SPECC1L AJ egonkortasunaren erregulatzaile berri gisa deskribatzen dugu PI3K-AKT seinaleztapenaren bidez.Zelularen mailan, SPECC1L gabeziak pan-AKT proteinaren maila jaitsi eta AJren sakabanaketa apikal-basala handitu zuen, AKT bidearen aktibazio kimikoaren bidez ezabatu zena.In vivo, Specc11-gabeziaren enbrioiek hodi neuralaren itxiera kaltetua eta CNCC disekzio murriztua erakusten dute.Horrela, SPECC1L-k aurpegiko morfogenesian CNCC funtzio normalerako beharrezkoa den zelulen atxikimenduan oinarritutako seinaleztapenean funtzionatzen du.
SPECC1L-k zelula-mailan duen eginkizuna ezaugarritzeko, SPECC1L18-n eskasia den U2OS osteosarkoma-lerro egonkorra erabili dugu.SPECC1L (kd) knockdown duten U2OS zelula egonkor hauek SPECC1L transkripzioen eta proteinen mailen jaitsiera moderatua (% 60-70) izan zuten, aktinaren zitoeskeletoaren migrazio eta berrantolaketaren akatsekin batera. SPECC1L akats mitotikoak eragiten dituela frogatu da 23 .Karakterizazio gehiago egin ondoren, gure SPECC1L-kd zelula egonkorrak morfologia aldatu zutela konfluentzia maila oso altuan (1. Irudia).Konfluentzia baxuko kontrol-zelulek eta kd-zelulek antzeko itxura zuten (1A, D irudia).Fusioaren ondoren 24 ordura, kontrol-zelulek forma kuboidea mantendu zuten (1B, E. irudiak), SPECC1L-kd zelulek luzatu egin ziren bitartean (1C, F. irudiak).Zelula-formaren aldaketa honen neurria kontrol-zelulen eta kd-zelulen in vivo irudien bidez jaso zen (1. filma).SPECC1L-k zelula konfluenteetan duen eginkizuna zehazteko, lehenik bere adierazpena aztertu dugu.SPECC1L proteina mailak fusioan handitu zirela ikusi genuen (1G irudia), SPECC1L transkripzio mailak ez ziren handitu (1H irudia).Gainera, zelulen dentsitatea handitu ahala, SPECC1L proteina zelulen arteko mugetan metatu zen (2A-E irudia), mintzari lotutako β-kateninarekin (2A'-E' irudia) gainjartzen den ereduarekin.SPECC1L aktina zitoeskeletoarekin 18,23 elkartea kontuan hartuta SPECC1L aktinan oinarritutako itsasgarri-junturak (AJ) elkarreragiten duela planteatu genuen.
(AF) SPECC1L knockdown (DF) zelulak luzatzen dira konfluentzia altuan (F) kontrol U2OS zelulekin (AC) alderatuta.Hemen erakusten dira zelula-dentsitate desberdinetarako hautatu ditugun sei denbora-puntuetatik hiru (T1, T3, T6).(G) Western blot analisia, SPECC1L proteina konfluentzia-maila altuan egonkortuta dagoela kontrol-zeluletan konfluentzia-maila baxuarekin alderatuta.SPECC1L-ren Western blot-ak espero diren 120 kDa-ko banda eta pisu molekular handiagoko banda erakusten ditu, baliteke translazio osteko eraldatua (*).Western blot analisia konfluentzia baxurako eta alturako baldintza berdinetan egin zen.Konfluentzia baxuan eta altuan SPECC1L erakusten duten irudiak blot beretik hartu ziren.Blot bera kendu eta berriro aztertu zen β-aktina antigorputzarekin.(H) RT-PCR analisi kuantitatiboak ez zuen aldaketa nabarmenik erakutsi SPECC1L transkripzio-mailetan.Errore-barrak lau esperimentu independenteetako SEMak adierazten dituzte.
(AE) Sei denbora-puntu (T1-T6) aukeratu ditugu zelula-dentsitate sorta bat adierazten duten zelulen formaren azterketa eta U2OS zeluletan AJ aldaketak SPECC1L knockdown (kd) normalizatzeko.Denbora-puntu horietako lehen bostek zelula bakarrak (T1), zelula-multzo txikien % 50-70eko fusioa (T2), kd zelulak birmoldatu gabe (T3), kd zelulak birmoldatzea (T4) eta 24 orduko aldaketak izan zituzten.kd (T5) zelulen atzeko forman.SPECC1L proteina zitoplasman sakabanatuta zegoen nagusiki T1 (A), baina bere metaketa zelulen arteko mugetan ikusi zen ondorengo denbora-puntuetan (B-E, geziak).(FJ) β-kateninak antzeko metaketa erakusten du AJ konplexuarekin lotutako zelulen arteko mugetan.(A'-E') SPECC1L eta β-kateninak zelulen ertzetan gainjartzen diren tindaketa erakusten dute zelula-dentsitate handian (geziak).(F'-J') SPECC1L-kd zeluletan, β-kateninaren tindaketa normala dirudi zelula-dentsitate baxuan (F'-H'), baina hedatzen da zelulen forma aldatzen den heinean (I', J'; geziak), AJ dela adieraziz. aldatu dira.Barrak = 10 µm.
Ondoren, SPECC1L gabeziak AJn duen eragina zehazten saiatu gara.AJ-ri lotutako hainbat markatzaile erabili ditugu, F-aktina, miosina IIb, β-katenina eta E-kadherina24,25,26,27 osagai kanonikoak barne.Aktina estresaren zuntzak SPECC1L-kd zeluletan gora egin zuen aurretik deskribatu bezala (3A,B irudiak) 18 .Aktina harizpiekin lotutako miosina IIb-k SPECC1L-kd zelulen antzeko hazkundea erakutsi zuen in vitro (3C,D irudiak).AJ-ri lotutako β-katenina kadherinarekin lotzen da zelula-mintzean, kontrol-kubozitoetan "abaraska" adierazpen-eredu normala erakutsiz (3E, G. irudiak).Interesgarria da, mikroskopia konfokala erabiliz irudi lauetan, β-katenina (3E, F irudia) eta E-cadherin (3G, H irudia) tindaketak SPECC1L-gabeziaren zelula konfluenteen zelula-mintzean tindaketa hedatuaren eredu nabarmenak erakutsi zituzten.Kd zeluletan AJ-ri lotutako β-kateninaren tindaketaren hedapen hau bat egiten zenean izan zen nabarmenena, baina zelula-formaren aldaketen aurretik zegoela ematen zuen (2F-J, F'-J' irudia).AJ tindaketa hedatu honen izaera fisikoa zehazteko, SPECC1L-kd U2OS zelulen gainazal apikal-basaleko zelulen ertzak aztertu genituen transmisio-mikroskopia elektronikoaren bidez (TEM) (3I, J irudia).Kontrol-zelulen aldean (3I. irudia), AJ-ren (geziak) adierazgarri diren elektroi trinko-eskualde bereiziak zituzten, kd-zelulek (3J. irudia) AJ-ren dentsitate elektroniko handiko eskualde handi eta ondokoak erakusten zituzten plano apikobasalean zehar..Horrez gain, zeharkako sekzioetan, kd zeluletan zelula-mintzaren tolestura zabalak ikusi genituen (S1A,B irudia), eta horrek β-katenina eta E-kadherina tindatzeko banden eredu hedatua azaltzen du (3F,H irudia).SPECC1L-ek AJetan duen eginkizunaren alde, β-catenina SPECC1L-rekin batera immunoprecipitatu zen U2OS zelula konfluenteen lisatuetan (3K. irudia).AJ markatzaileentzako immunostaining hedatuarekin batera, TEM analisia koherentea zen gure hipotesiarekin SPECC1L gabeziak AJ apical-basal dentsitatea eta bariantza areagotzen duela.
(AH) Kd zeluletan F-aktinaren tindaketa handitu egin zen fusioaren ondorengo 48 orduetan (T6; A, B).F-aktinarekin lotutako miosina IIb-ren tindaketa aldatua (C, D).Kontroleko zeluletan (E, G) β-katenina eta E-cadherin mintzaren tindaketa eredu leuna hobetu zen SPECC1L-kd (F, H) zeluletan.Barrak = 10 µm.(I–J) Mikrografia elektronikoak zelula arteko lotura apika-basala behatuz.Kontrol-zelulek elektroi trinkoko eskualde desberdinak erakusten dituzte elkargune itsaskorrak adierazten dituztenak (I, geziak).Aitzitik, SPECC1L-kd zeluletan juntura apikal-basal osoa elektroi trinkoa agertzen zen (J, geziak), lotura itsasgarrien dentsitatea eta sakabanaketa handitzea adieraziz.(K) β-katenina SPECC1Lrekin batera immunoprecipitatu zen U2OS zelula lisatu konfluenteetan.Leku batetik hartutako irudia, lau esperimentu independenteetako bat adierazten duena.
SPECC1L-ek kraneo-aurpegiaren morfogenesian duen eginkizuna ulertzeko, Specc1l eskaseko sagu-eredu bat sortu dugu ES tranpa zelula-lerro independente bi erabiliz, DTM096 eta RRH048 (BayGenomics, CA), 1 introna adierazten dutenak eta Specc1l transkripzioak 15ean harrapatu ziren (1. irudia). .4A, S2 irudia).Decoy bektorearen txertaketaren kokapen genomikoa genoma osoaren sekuentziazioaren bidez zehaztu zen eta PCR bidez baieztatu zen (S2. irudia).Bi gene-tranpa-diseinuek Specc11-lacZ kazetarien marko-fusioa ere ahalbidetu zuten harrapatzeko orduan.Hori dela eta, X-gal tindaketaren bidez zehaztutako lacZ adierazpena Specc11 adierazpenaren adierazle gisa erabili zen.Bi aleloek antzeko lacZ adierazpen-ereduak erakutsi zituzten, 1. introian DTM096 genearen tranpak RRH048 baino adierazpen indartsuagoa erakusten zuen 15. intronean (ez da ageri).Hala ere, Specc1l oso adierazgarria da, E8.5 tolestura neuronaletan (4B irudia), E9.5 eta E10.5 (4C,D irudia) hodi neuronalean eta aurpegiko prozesuetan (4C,D irudia) eta gorputz-adarretan garatzen direnean. E10ean.5 eta begiak (4D irudia).Aurretik jakinarazi genuen E10.5-eko lehen arku faringeko SPECC1L adierazpena epitelioan eta azpiko mesenkiman18an zegoela, CNCC leinuarekin bat.CNCC-n SPECC1L adierazpena probatzeko, E8.5 tolestura neuronalak (4E-J irudia) eta E9.5 burezurreko atalak (4K- irudia) egin genituen.E8.5-n, SPECC1L-k toles neuronalak tindatu zituen biziki (4E, H. irudia), NCC markatzaileekin tindatutako zelulak barne (4G, J irudia).E9.5-n, SPECC1L (4K irudia, N) biziki tindatu zuen CNCC migratzailea AP2A (4L, M irudia) edo SOX10 (4O, P irudia)rekin batera tindatua.
(A) Saguaren Specc11 genearen irudikapen eskematikoa ES DTM096 (intron 1) eta RRH048 (intron 15) zelula klonetan decoy bektore txertaketa erakusten duena.(BD) Specc1lDTM096 enbrioien lacZ tindaketa Specc1l adierazpena adierazten dutenak E8.5etik E10.5era.NE = neuroektodermoa, NF = tolestura neural, PA1 = lehen arku faringeoa.(EP) SPECC1L immunostaining AP2A eta SOX10 NCC markatzaileekin E8.5 (NF; EJ) tolestura neuronalean eta E9.5 (KP) garezurreko ataletan.SPECC1L tindaketa asko ikusi zen E8.5 tolestura neuronaletan (E, H; gezi-puntetan), AP2A (F, G; gezi-puntak) eta SOX10 (I, J; gezi-puntak) etiketatu dituzten zelulak barne.E9.5-n, SPECC1L-k biziki zikindu zituen CNCC migratzaileak (K, N; geziak) AP2A (L, M; geziak) eta SOX10 (O, P; geziak) etiketatuak.
Specc1lDTM096/+ eta Specc1lRRH048/+ sagu heterozigotoen artean gurutzatzeak erakusten du gene-tranpa-aleloak ez direla osagarriak eta heterozigoto konposatuak eta enbrioi-homozigotoak bi gene-tranpa alelorako enbrioi-hilgarriak direla (S1 taula).Mendelian ratioek jaiotzean heterozigotoen biziraupen-tasa jaitsi zela adierazi zuten (espero zen 1,34 vs. 2,0).Heterozigotoen artean hilkortasun perinatal baxua antzeman genuen, batzuek anomaliak kraneo-azalekoak zituzten (S3. irudia).Hala ere, fenotipo perinataleko kranio-aurpegi hauen sartze baxuak zaildu egiten du haien azpiko mekanismo fisiopatofisiologikoak aztertzea.Hori dela eta, Specc11 mutante homozigotikoen fenotipo hilgarri enbrionarioan zentratu ginen.
Specc1lDTM096/RRH048 enbrioi mutante heterozigoto edo homozigoto konposatu gehienak ez ziren E9.5-10.5 ondoren garatu (5A-D irudiak), eta hodi neuralak ez zuen aurrealdetik ixten (5B, D irudiak) eta batzuetan atzetik ixten zen (ez da erakusten). ..Garezurreko hodi neuralaren ixteko akats hau E10.5-n tolestura neuraletan geratzen den CNCC markatutako DLX2 gehienekin lotuta zegoen, disekziorik ez dagoela adieraziz (5A'-D' irudia).CNCC-ren tamaina orokorra ere murriztu den zehazteko, CNCC lerroak GFP-rekin etiketatu ditugu gure gene-tranpa-lerroetan Wnt1-Cre eta ROSAmTmG-ekin.Enbrioi osoetatik GFP+ NCC eta GFP- (RFP+) ez NCC sailkatuak igortzen ditugu.E9.5-n, fluxu-ordenatutako GFP-etiketatutako CNCC-en proportzioa ez zen nabarmen aldatu WT eta enbrioi mutanteen artean (ez dira erakusten), CNCCren zehaztapen normala adieraziz.Hori dela eta, jasandako toles neuronaletan (5B' irudia) hondar Wnt1-Cre eta DLX2 tindaketa CNCC geruza akastunaren ondorioz izan zela hipotesia genuen, ziurrenik AJ zelulen dentsitatea edo sakabanaketa handitzearen ondorioz, SPECC1L-kd zeluletan ikusten den moduan.NCC markatzaileak SOX10, AP2A eta DLX2 erabili ditugu tolestura neuronalean CNCCren presentzia baieztatzeko (5E-R irudia).E8.5-n, hiru NCC markatzaileen tolestura neuralaren tindaketa ikusi zen WT (5E, G, I) eta Specc1l mutantearen ataletan (5F, H, J irudiak).E9.5ean, NCC markatzaileek NCC migratzailea WT ataletan zikindu zuten bitartean (5M, O, Q irudia), Specc1l enbrioi mutanteen tolestura neuraletan ikusi zen hondar NCC tindaketa (5N, P, R irudia).SOX10 eta DLX2-k CNCC migratzaileak markatzen dituztenez, emaitza honek iradokitzen du SPECC1L gabeziak diren CNCC-ek migrazio osteko zehaztapena lortzen dutela baina ez dutela tolestura neuronaletatik migratzen.
Specc11 gabeziak hodi neural akastunaren itxiera dakar, garezurreko gandor neuronalaren zelulen eta AJ-en delaminazioa.
(A, B') E9.5 WT (A) Wnt1-Cre-rekin (A') etiketaturiko garezurreko gailur neuronalaren zelulak (CNCC) migratzen dituen enbrioia.Aitzitik, Specc11 enbrioi mutanteek tolestura neural irekiak (B), gezi-puntak) eta migratu ez diren CNCC-ak erakusten dituzte (B', gezi-puntak).(C, D') E10.5 WT enbrioien (C, C') eta Specc1l (D, D') CNCC markatzailearen DLX2 eremu argiko irudiak (C, D') eta immunotinketa (C', D').WT E10.5 enbrioietan, DLX2-positibo CNCC-k branka-arkuak kolonizatzen ditu (C', geziak), eta mutanteetan, berriz, tindaketa nabarmenak irauten du tolestura neural irekietan (D', geziak) eta lehen arku faringeoetan (D', geziak).) kolorazio batzuekin (geziak) CNCC-ren delaminazio eta migrazio eskasa adierazten dutenak.ER) E8.5 (E-L) eta E9.5 (M-R) faseetako WT eta Specc1l enbrioi mutanteen atalak NCC markatzaileekin etiketatu ziren SOX10 (E, F, M, N), AP2A (G, H, O, P ) eta DLX2 (I, J, Q, R).E8.5ean, NCC tindaketa behatu zen tolestura neuronal basatian (NF) eta sekzio mutanteetan.E8.5 WT-n (K) eta mutantean (L) SOX10 eta β-kateninaren ko-tindaketak β-kateninaren tindaketa areagotu egin zuen tolestura neuronaleko zelulen mugetan.E9.5-n, CNCC migratzaileen (M, O, Q) mota basatiaren tindaketa ikusi zen, eta mutanteetan, estratifikatu gabeko CNCCek tolestura neural irekiak tindatu zituzten (N, P, R).(S–Z) E9.5 mutazioa duten WT eta Specc11DTM096/RRH048 enbrioien atal koroaletan AJ etiketatze azterketa in vivo.Gutxi gorabeherako sekzio-plano bat ageri da goiko eskuineko izkinan.Ehun mutanteen ataletan, F-aktina (S, T) eta miosina IIb (U, V) tindaketa areagotu egin da.3. irudiko in vitro emaitzen antzera, enbrioi mutanteetan, β-kateninaren (W, X) eta E-kadherinaren (Y, Z) mintzaren tindaketa hobetua ikusi zen.(AA-BB) Zelula apikal-basalaren ertzetik haratago begiratzen den enbrioi basati baten atal baten mikrografia elektronikoak elektroi trinkoko eskualde bereizi bat erakusten du itsasgarri-junturaren adierazgarri (AA, geziak).Aitzitik, Specc11 enbrioi mutanteen ataletan (BB, geziak), juntura apicobasal osoa elektroi trinkoa da, eta itsasgarri-junturak dentsitate eta sakabanaketa handitu direla adierazten du.
Geruza murriztua AJ alteratuaren ondoriozkoa den gure hipotesia probatzeko, Specc1l enbrioi mutanteen tolestura neuraletan AJ etiketatzea aztertu dugu (5S-Z irudia).Aktina-estres-zuntzen areagotzea ikusi dugu (5S, T irudia) eta aktina-zuntzetan miosina IIB tindaketaren lokalizazioa areagotu dela (5U, V irudia).Garrantzitsuena, β-kateninaren (5W, X irudia) eta E-kadherinaren (5Y, Z irudia) zelulen arteko mugetan tindaketa handiagoa ikusi genuen.NCCren β-katenina tindaketa ere aztertu dugu E8.5 enbrioien tolestura neuraletan (5K, L. irudia).β-kateninaren tindaketa indartsuagoa zen Specc1l mutanteen tolestura neuronaletan (5L eta K. irudiak), AJ aldaketak hasi zirela iradokiz.E9.5 enbrioien garezurreko atalen mikrografi elektronikoetan, Specc1l enbrioi mutanteetan elektroi trinkoko tindaketa hedatu handiagoa ikusi genuen WTrekin alderatuta (5AA, BB eta S1E-H irudiak).Batera hartuta, emaitza hauek SPECC1L-kd U2OS zeluletan ditugun in vitro emaitzak onartzen dituzte eta iradokitzen dute AJ tindaketa aberrantea CNCC estratifikazioaren aurretik dagoela gure enbrioi mutanteetan.
AKT jardueraren eta E-kadherinaren egonkortasunaren arteko erlazio antagoniko ezaguna ikusita,17,28 PI3K-AKT seinaleztapenaren inplikazioaren hipotesia planteatu genuen.Horrez gain, gure enbrioi mutante batzuetan hilkortasunetik ihes egin zuten (% 5) babak subepidermikoak ikusi genituen E9.5-10.5ean eta, horren ordez, E13.5 inguruan finkatu ziren (S3. irudia).Besikula subepidermalak PDGFRα12n oinarritutako PI3K-AKT seinaleztapen murriztuaren bereizgarria dira.Fantauzzo et al.(2014) PDGFRα-n oinarritutako PI3K aktibazioa etentzeak PdgfraPI3K/PI3K enbrioi mutanteetan besikula subepidermalak, hodi neuralaren akatsak eta ahosabaiaren fenotipoak sortzen ditu.Izan ere, pan-AKT eta Ser473-AKT fosforilatu aktiboaren mailak in vivo murriztu ziren Specc1l ehun mutanteetan E9.5 enbrioiaren geldialdira (6A-D irudia).Ser473-AKT fosforilatuaren mailen beherakada erabat in vivo (6E. IRUDIA) eta in vitro (6F. IRUDIA) pan-AKT-ren mailen jaitsieraren ondoriozkoa izan daiteke.U2OS zelulak zelulen forma eta AJ dentsitatearen aldaketekin oso elkartzen zirenean soilik ikusi zen in vitro (6D irudia).Horrela, gure datuek iradokitzen dute SPECC1L PI3K-AKT seinaleztapenaren erregulatzaile positibo berri bat dela kraneo-aurpegiaren morfogenesian.
(A–E) E8.5 (A,B) eta E9.5 (C,D) burezurreko atalak edo Specc1l enbrioi mutanteen (E) lisateak S473-AKT fosforilatuaren eta pan-AKT Proteinen murrizketa aktiboaren maila erakusten dutenak , WT kontrolarekin alderatuta.Western blotting mota basatiko lisatuetan eta lisatu mutanteetan egin zen baldintza berdinetan.SPECC1L-rako erakutsitako irudiak blot batetik hartu ziren.Blot bera kendu eta berriro aztertu zen pan-ACT eta β-actin antigorputzekin.Pan-AKT maila E8.5 tolestura neuraletan (A, B) eta S473-AKT fosforilatuaren mailak E9.5 burezurreko ataletan nabarmen murriztu ziren.(F) Pan-AKT mailak antzera murriztu ziren SPECC1L-kd U2OS zelulen lisatuetan konfluentzia handian bildutakoetan.Errore-barrak hiru Western blot kuantifikazio independenteetako SEMak adierazten dituzte.(GJ) E9.5-eko WT enbrioien atalak KI67rekin eta 3 kaspasa moztuarekin tindatuak, hurrenez hurren, zelulen ugalketa (G, G') eta jarduera apoptotiko txikia (H, H') erakutsiz.Specc11 enbrioi mutanteek zelula-ugalketa konparagarria erakusten dute (I), baina apoptosia jasaten duten zelulen kopurua nabarmen handitzen da (J).
Gero, ugalketa eta apoptosiaren markatzaileak aztertu ditugu.Ez dugu desberdintasunik ikusi E9.5 enbrioien ugalketan (6E irudia, G I-rekin alderatuta) %82,5eko ugaltze-indizearekin WT mutanteentzat eta %86,5eko Specc1l mutanteentzat KI67 tindaketaren bidez neurtuta (p <0,56, Fisher-en). proba zehatza).Era berean, ez dugu desberdintasunik ikusi E8.5-n tolestura neuraletan 3 caspasa moztuta tindatuz neurtutako apoptosian enbrioia gelditu arte (ez da ageri) (ez da ageri).Aitzitik, apoptosia nabarmen handitu zen E9.5 enbrioi mutante guztietan (6F, H eta J irudia).Apoptosiaren igoera orokor hau PI3K-AKT seinaleztapen murriztuarekin eta enbrioiaren hilkortasun goiztiarrarekin bat dator29,30,31.
Ondoren, PI3K-AKT seinaleztapenaren kausa-funtzioa baieztatzeko gure kd zeluletan AJ aldaketetan, kontrol eta kd zeluletan bidea kimikoki aldatu genuen (7A-F irudia).Markatzaile gisa SPECC1L-kd zelula konfluenteetan ikusitako zelulen forma aldaketaren fenotipoa erabili dugu, zeina dimentsio luzeenaren (luzera) eta dagokion dimentsio bertikalaren (zabaleraren) erlazioa erabiliz kuantifikatu genuen.1eko ratioa espero da zelula biribil samarrak edo kuboideetarako (7G irudia).Zelulen formaz gain, β-katenina tindaketaren bidez AJ-n duen eragina ere baieztatu dugu (7A'-F' irudia).Wortmannina erabiliz PI3K-AKT bidearen inhibizioa nahikoa izan zen kontrol-zeluletan zelulen forma aldatzeko (7A, C irudia) eta AJ (7A' irudia).SC-79 PI3K-AKT aktibatzaileak ez zuen zelulen forman (7A, E FIG.) edo AJ hedapenean (7A' FIG.) eraginik izan kontrol-zeluletan.SPECC1L-kd zeluletan, PI3K-AKT bidea gehiago kentzeak apoptosia areagotu zuen (7B,D irudiak) eta β-katenina tindaketa nabarmen handitu zen (7B' irudia), gure in vivo mutante astunekin bat etorriz.Garrantzitsua da PI3K-AKT bidearen aktibazioa zelulen forma (7B, F irudia) eta AJ fenotipoak (7B irudia) hobetu zituela.Zelula-formaren aldaketak zelulen biribiltasun ratioa (CCR) gisa kuantifikatu eta esanguragatik alderatu ziren goian deskribatutako moduan (7G. IRUDIA).Izan ere, kontrol-zeluletan (7G. irudia, CCR = 1.56), wortmannina tratamendua nahikoa zen zelulen forma nabarmen aldatzeko (7G. irudia, CCR = 3.61, p <2.4 × 10-9) ikusitakoaren antzeko neurrian. SPECC1L-n.-kd zelulak (7G. irudia, CCR = 3,46).SPECC1L-kd zelulen wortmannina tratamendua (7G. irudia, CCR = 3.60, arbuiagarria) ez zen tratatu gabeko kd zelulak (7G. irudia, CCR = 3.46, arbuiagarria) edo wortmanninaz tratatutako kontrol zelulak (7G. irudia) baino esanguratsuagoa izan., CCR = 3,46, arbuiagarria) gainera zelularen luzapenari eragiten dio (7G, CCR = 3,61, arbuiagarria).Garrantzitsuena, SC-79 AKT aktibatzaileak SPECC1L-kd zelulen fenotipo luzea berreskuratu zuen (7G. irudia, CCR = 1,74, p <6,2 × 10-12).Emaitza hauek baieztatzen dute SPECC1L-k PI3K-AKT seinaleztapena erregulatzen duela eta iradokitzen dute SPECC1L-ren neurrizko jaitsierak zelulen atxikimenduan eragiten duela, eta beherakada indartsu batek apoptosia eragiten duela (8. irudia).
(A-F') Kontrol (A, C, E) eta SPECC1L-kd (B, D, F) zelulak PI3K-AKT bide inhibitzaile wortmannina (C, D) edo SC-79 aktibatzeko (E, F) tratamendua .Tratatu gabeko kontrol-zelulak kuboidalak (A) dira β-katuaren tindaketa zelular normalarekin (A'), eta kd zelulak luzangakoak dira (B) β-katuaren tindaketa handituarekin (B').PI3K-AKT bidea kendu ondoren, kontrol-zelulak luzatu egin ziren (C) β-katuaren hedapenarekin (C'), kd zelulak apoptosia jasaten hasi ziren bitartean (D), gure enbrioi oso mutatuen antzera eta β-katua oso hobetua erakutsiz.tindaketa (D').PI3K-AKT bidea aktibatu ondoren, kontrol-zelulak kuboidalak (E) mantendu ziren eta β-katua (E') tindaketa normala zuten, kd zelulek zelulen forma (F) eta β-katua (F') tindaketa nabarmen hobetu zuten bitartean, adieraziz. (G) Zelula-formaren (AF) aldaketa-maila kuantifikatu zen dimentsio (luzera) eta dagokion dimentsio bertikala (zabalera) MetaMorph softwarea erabiliz zelula biribiltasun ratioa (CCR) erabiliz.Tratatu gabeko (NT) SPECC1L-kd zelulak (CCR = 3.46) kontroleko zelulak baino nabarmen luzeagoak ziren (CCR = 1.56, p <6.1 × 10-13).Wort-ek kontrol-zeluletan PI3K-AKT bidearen inhibizioa nahikoa izan zen zelula-forman antzeko luzapena eragiteko (CCR=3,61, p<2,4 × 10-9).Era berean, SC-79-k SPECC1L-kd zeluletan AKT aktibazioak zelulen luzapena berreskuratu zuen kontrol-mailetara (CCR = 1.74, p <6.2 × 10-12).SPECC1L-kd zelulen wortmannina tratamenduak apoptosia areagotu zuen, baina zelulen forma aldaketan (CCR=3.60) gehiago handitu ez zen tratatu gabeko kd (CCR=3.46, ns) edo wortmanninaz tratatutako kontrol-zelulekin (3.61) alderatuta.ns = berdin dio.+/- 50 gelaxken SEM neurriak erakusten dira.Desberdintasun estatistikoak Student-en t-testaren bidez kalkulatu dira.
(A) PI3K-AKT bidearen inhibizioaren eta aktibatzeko irudikapen eskematikoa, AJ aldaketak eta erreskatea eraginez, hurrenez hurren.(B) SPECC1L bidez AKT proteina egonkortzeko proposatutako eredua.
Migrazio aurreko CNCCek AJ lisia behar dute aurreko tolestura neuralaren zelula neuroepitelialetatik bereizteko1,15,32.AJ osagaien tindaketa areagotzeak eta AJ apikal-basalaren banaketa asimetrikoa galtzeak SPECC1L gabezia duten zeluletan bai in vitro bai in vivo, SPECC1L-ren β-cateninarekiko hurbiltasun fisikoarekin konbinatuta, SPECC1L-k AJ tokiko egonkortasuna behar bezala mantentzeko funtzionatzen duela iradokitzen du. antolaketa muskuluak.aktina zitoeskeletoa.SPECC1L aktina-zitoeskeletoarekin eta β-kateninarekin elkartzea eta aktina-harizpi kondentsatuen kopurua handitzea SPECC1L-ren gabezian bat datoz AJ dentsitatearen igoerarekin.Beste aukera bat da SPECC1L gabeziako zeluletan aktina zuntz kopurua handitzeak zelulen arteko tentsioaren aldaketa ekartzea.Estres zelularrak AJ 33 dinamikari eragiten dionez, tentsio-aldaketek AJ 34 lausoagoa eragin dezakete.Beraz, edozein aldaketak CNCC geruzetan eragina izango du.
Wnt1 gandor neuronalaren zelulak sortzen dituzten tolestura neuronal goiztirretan adierazten da.Horrela, Wnt1-cre leinuaren trazaketak NCC35 aurreko zein migrazioa markatzen du.Hala ere, Wnt1-ek tolestura neuronal goiztiarretatik eratorritako dorsal-ehunen klonak ere markatzen ditu 35,36, eta litekeena da tolestura neural irekietan Wnt1 markatzaileentzako E9.5 mutanteen tindaketa CNCC ez izatea.AP2A eta SOX10 NCC markatzaileetarako egindako tindaketa positiboak baieztatu zuen Specc11 enbrioi mutanteen tolestura neuronalak agerian zituztela CNCC.Horrez gain, AP2A eta SOX10 migrazio goiztiarreko NCCren markatzaileak direnez, tindaketa positiboak adierazi zuen zelula hauek migrazio osteko CNCC direla, eta ezin dira estratifikatu E9.5.
Gure datuek iradokitzen dute SPECC1L-ren AJ-ren erregulazio molekularra PI3K-AKT seinaleztapenaren bidez egiten dela.AKT seinaleztapena SPECC1L eskaseko zeluletan eta ehunetan murrizten da.Fantauzzo et al.en aurkikuntzak.PI3K-AKT seinaleztapenaren zeregin zuzena onartzen dute kranio-aurpegiaren morfogenesian.(2014) PDGFRα-n oinarritutako PI3K-AKT seinaleztapenaren aktibazio ezak ahosabaiaren fenotipoa ekartzen duela erakutsi zuten.Era berean, PI3K-AKT bidearen inhibizioa nahikoa dela erakusten dugu U2OS zeluletan AJ eta zelulen forma aldatzeko.Gure aurkikuntzekin bat, Cain et al.37-k erakutsi zuen PI3K α110 azpiunitatearen beheranzko erregulazioak zelula endotelialetan β-katenina perizelularraren tindaketa antzeko gehikuntza eragiten duela, "konektibitate indizea" handitzea deritzona.Hala ere, aktina-harizpiak dagoeneko oso antolatuta dauden zelula endotelialetan, PI3K-AKT bidea kentzeak zelula forma solte bat eragiten du.Aitzitik, SPECC1L-kd U2OS zelulek zelula forma luzanga erakusten zuten.Desberdintasun hori zelula mota espezifikoa izan daiteke.PI3K-AKT seinaleztapenak aktinaren zitoeskeletoari etengabe eragiten dion bitartean, zelulen forman eragina aktina zuntz zentralen dentsitatean eta antolaketan eragindako tentsio aldaketek zehazten dute.U2OS zeluletan, zelulen forma aldaketak bakarrik erabili ditugu SPECC1L-ren gabezia AJ aldaketa eta berreskurapenaren markatzaile gisa.Amaitzeko, hipotesia dugu SPECC1L gabezian AKT bidearen inhibizioak AJ egonkortasuna areagotzen duela eta CNCCn delaminazioa murrizten duela.
Interesgarria da, pan-AKT mailak in vitro eta in vivo murriztu ziren 473-AKT fosforilatuen mailaz gain SPECC1L-ren ezean, PI3K-AKT seinaleztapena AKT proteinaren egonkortasun edo fakturazio mailan erregulatzea iradokituz.SPECC1L eta MID1 geneek, biak Opitz/GBBB sindromearekin lotutakoak, mikrotubuluak egonkortzen dituzten proteinak kodetzen dituzte 18,22.Ez da guztiz ulertzen SPECC1L eta MID1 mikrotubuluen egonkortzea bitartekari duten mekanismoa.SPECC1L-ren kasuan, egonkortze honek mikrotubuluen azpimultzo baten azetilazio hobetua barne hartzen du 18 .Baliteke SPECC1L-k antzeko mekanismo bat erabiltzea AKT bezalako beste proteinak egonkortzeko.Frogatuta dago AKT proteinan lisina-hondakinen azetilazioak mintzaren lokalizazioa eta fosforilazioa gutxitzea dakarrela38.Horrez gain, K63 katearen ubikitinazioa AKTko lisina-hondar berean behar da bere mintza lokalizatu eta aktibatzeko39,40.SPECC1L proteinekin elkarreraginean dauden hainbat faktoreren artean, errendimendu handiko legamia bi pantaila hibridoetan identifikatutako hainbat faktoreren artean, lau - CCDC841, ECM2942, APC eta UBE2I43 - proteinen fakturazioan edo egonkortasunean inplikatu dira ubiquitination edo sumoylation bidez.SPECC1L-k AKT lisina-hondakinen itzulpen-ondoko aldaketetan parte hartu dezake, AKT egonkortasunean eraginez.Hala ere, SPECC1L-k AKT proteinaren lokalizazioan eta egonkortasunean duen eginkizun kritikoa argitu gabe dago.
SPECC1L adierazpenaren akats larriek in vivo AJ markatzaileen tindaketa eta CNCC gainjartze akastunak areagotu zituzten, baita apoptosia eta enbrioiaren hilkortasun goiztiarra areagotu ere.Aurreko txostenek erakutsi dute apoptosi-maila handiagoa duten sagu mutanteek hodi neuralaren akatsekin 44,45,46,47 eta kranio-aurpegiko akatsekin48.Iradoki da tolestura neuraletan edo faringe-arkuetan gehiegizko heriotza zelulak mugimendu morfogenetiko egokirako beharrezkoak diren zelula kopuru nahikoa ez izatea eragin dezakeela 48,49,50.Aitzitik, gure SPECC1L eskaseko zelula-lerroek SPECC1L adierazpen neurriz murriztua zuten AJ aldaketak bakarrik erakutsi zituzten zelulen heriotza areagotzearen frogarik gabe.Hala ere, Kd zelula hauetan PI3K-AKT bidearen inhibizio kimikoak apoptosia areagotu zuen.Horrela, SPECC1L adierazpenaren edo funtzioaren gutxitze moderatuak zelulen biziraupena bermatzen du.Hau koherentea da st. atxilotzetik ihes egiten duten Specc11 enbrioi mutante arraroen behaketarekin.E9.5 —geneak harrapatzeko eraginkortasun murriztearen ondorioz agian— beren hodi neuralak ixteko eta garapenean beranduago gelditzeko gai dira, askotan kraneo-aurpegiko akatsekin (S3. irudia).Horrekin bateragarria da, halaber, Specc1l enbrioi heterozigotikoen agerraldi arraroa garezurreko anomaliak dituztenak (seguru asko geneak harrapatzeko eraginkortasuna handitzearen ondorioz) eta baita zebra-arrainetan bi SPECC1L ortologoetako batek (specc1lb) enbrioi-fenotipo berantiarrak eragiten dituena, horien galera barne. beheko barailak eta aldebiko arrakalak51.Horrela, giza pazienteetan identifikatutako SPECC1L funtzio galera heterozigotoek SPECC1L funtzioaren narriadura txikiak eragin ditzakete kraneo-aurpegiaren morfogenesian, haien orofacial-arrailak azaltzeko nahikoa.SPECC1L-n oinarritutako zelulen arteko kontaktuen erregulazioak ere papera izan dezake arku faringekoen palatogenesian eta fusioan.SPECC1L funtzioaren azterketa gehiago zelulen arteko aldi baterako kontaktuek CNCCn hodi neuralaren itxieran zelula neuroepitelialaren mugikortasunean eta kranio-aurpegi-morfogenesian duten papera argitzen lagunduko dute.
U2OS osteosarkomaren kontrola eta SPECC1L-kd zelulak deskribatu dira aurretik (Saadi et al., 2011).SPECC1L-ren aurkako antigorputzak ere ezaugarritu dira aurretik (Saadi et al., 2011).β-kateninaren aurkako antigorputzak (untxia; 1:1000; Santa Cruz, Dallas, TX) (sagua; 1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), miosina IIb (1:1000; Sigma-Aldrich, St. Louis ) , MO) ), E-cadherin (1:1000; Abkam, Cambridge, MA), AP2A (1:1000; Novus Biologicals, Littleton, Kolo.), SOX10 (1:1000; 1000; Aviva Systems Biology, San Diego , Kalifornia), DLX2 (1:1000; Abcam, Cambridge, MA), phospho-Ser473-AKT (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), pan-AKT (1:1000; ThermoFisher Scientific, Waltham, MA). ), KI67 (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA), 3 caspasa zatitua (1:1000; Cell Signaling Technology, Danvers, MA) eta β-aktina (1:2500; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO ) deskribatutako moduan erabili zen..Aktina harizpiak Acti-stain rhodamine phalloidinarekin tindatu ziren (Cytoskeleton, Denver, Colorado).
U2OS kontrol-zelulak eta SPECC1L-kd zelulak glukosa handiko DMEM estandarrean hazi ziren fetuaren % 10eko behi-serumarekin (Life Technologies, Carlsbad, CA).AJ aldaketetarako, 2 x 105 zelula hazi ziren %0,1eko txerri-gelatinaz tratatutako beiran (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) eta zelularen forman aldaketak ikusi ziren.Zelulak adierazitako denbora-puntu ezberdinetan bildu ziren: landatu eta 4 ordura (t = 1), hazi eta 24 ordura (t = 2), zelula-formaren aldaketarik gabe elkartzea (t = 3), zelula-formaren aldaketa (t = 4) , 24 h zelula forma aldatu ondoren (t = 5) eta 48 h zelula forma aldatu ondoren (t = 6) (Irud. 1, 2, 3).PI3K-AKT bidea modulatzeko, zelulak adierazitako kontzentrazioetan hazi ziren PI3K-AKT inhibitzaile wortmanninarekin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis, Minnesota) edo SC-79 aktibatzailearekin (TOCRIS Biosciences, Minneapolis Adams, Minnesota).Produktu kimikoak zituen euskarria egunero aldatzen zen.
Fotogramaz fotograma grabaketak zuzeneko kontrolean eta KD zeluletan egin ziren kultura-baldintza normaletan, eta fase-kontrastearen irudiak 10 minutuz behin bildu ziren 7 egunez.Irudiak ordenagailuz kontrolatutako Leica DM IRB alderantzizko mikroskopio baten bidez eskuratu ziren, etapa mekaniko batekin eta QImaging Retiga-SRV kamera batekin konektatutako 10 × N-PLAN helburu batekin.Irudietan zehar, zelula-kulturak 37 °C-tan mantendu ziren atmosfera heze batean, %5eko CO2-arekin.
Regional Mutant Mouse Resource Centerreko (UC Davis, CA) bi gene tranpako ES zelula-lerro DTM096 eta RRH048 erabili ziren Specc11 eskaseko sagu-lerroak sortzeko, Specc1lgtDTM096 eta Specc1lgtRRH046 izendatuta.Laburbilduz, 129/REJ ES zelulak C57BL6 blastozistoetan injektatu ziren.Ondorioz, sagu ar kimerikoak C57BL6 sagu emeekin hazi ziren, agouti-kolorazio koloreko kumeak identifikatzeko.Heterozigotoak identifikatzeko gene tranpa bektorialen txertatzeen presentzia erabili zen.Saguak 129/REJ;C57BL6 hondo mistoan mantendu ziren.Tranpa genetikoaren bektorearen txertatze gunearen kokapena RT-PCR, genomaren sekuentziazioa eta osagarri genetikoa (1. irudi osagarria) baieztatu zen.Specc1lGT sagu heterozigoto bikoitzen CNCC leinuaren jarraipena egiteko, ROSAmTmG (#007576) eta Wnt1-Cre (#003829) saguak (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) gurutzatu ziren ROSAmTmG eta Wnt1-Cre aleloa Speccry1l mutantean ekoizteko.Saguetan egindako esperimentu guztiak Kansaseko Unibertsitate Medikuntzako Animalien Zainketa eta Erabilera Batzordeak onartutako protokoloen arabera egin ziren.
Enbrioiak finkatu ziren (% 1 formaldehido, % 0,2 glutaraldehido, 2 mM MgCl2, % 0,02 NP-40, 5 mM EGTA) 60 minutuz giro-tenperaturan.X-gal tindaketa-disoluzioan finkatu ondoren (5 mM potasio ferrizanuroa, 5 mM potasio ferrozianuroa, 2 mM MgCl2, % 0,01 sodio desoxikolatoa, % 0,02 NP-40, 1 mg/ml X-gal) Orbanen garapena 37 °C-tan egin zen. .°C 1-6 ordu barru.Enbrioiak % 4ko PFAn finkatu eta bistaratu ziren.
Western blotting egiteko, zelulak lisis pasiboko buffer batean (Promega, Fitchburg, WI) lisatu ziren HALT proteasaren inhibitzaileen nahasketa batekin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).Lisatoak %12ko poliakrilamida Mini-PROTEAN TGX prest egindako geletan prozesatu ziren (Bio-Rad, Hercules, CA) eta Immobilon PVDF mintzetara transferitu ziren (EMD Millipore, Billerica, MA).Mintzak % 5eko esnetan blokeatu ziren % 0,1 Tween zuen PBSn.Antigorputzak gau osoan inkubatu ziren 4 °C-tan edo ordubetez giro-tenperaturan.Femto SuperSignal West ECL erreaktiboa (Thermo Scientific, Waltham, MA) erabili zen seinalea sortzeko.Inmunotinketa egiteko, enbrioiak gauean finkatu ziren % 4 PFA/PBS-n eta kriokontserbatu.Ehun kriosekzioek %1 ahuntz-serum normala (Thermo Scientific, Waltham, MA) eta %0,1 Triton X-100 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) zeuzkan PBSn blokeatu ziren eta, ondoren, inkubagailu batean 4 °C-tan inkubatu ziren. gaua.antigorputzarekin eta bigarren mailako antigorputz fluoreszentearekin (1:1000) ordubetez 4°C-tan.Tindutako atalak ProLong urrezko euskarrian jarri ziren (Thermo Scientific, Waltham MA) eta irudi lauak lortu ziren Leica TCS SPE mikroskopio konfokalarekin.Inmunotinketa bakoitza gutxienez bi enbrioi mutanteren zirossekzioetan hiru esperimentu independente gisa egin zen.Esperimentu adierazgarri bat erakusten da.
Zelulak RIPA buffer eraldatuan inkubatu ziren (20 mM Tris-HCl, pH 8,0, % 1 NP-40, 130 mM NaCl, % 10 glizerola, 2 mM EDTA eta HALT proteasaren inhibitzailea (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)) Laburbilduz, lisadoak proteina G ale magnetikoekin (Life Technologies, Carlsbad, CA) aldez aurretik purifikatu ziren eta, ondoren, gauean inkubatu ziren 4° C-tan. anti-SPECC1L edo IgG proteina G proteina aleekin erabili ziren SPECC1L erauzteko eta Western blotting egin zen anti-a erabiliz. Goian deskribatutako -β-cateninaren antigorputza Erakusten diren co-IP esperimentuak lau esperimentu independenteren adierazgarriak dira.
Laborantza finkoko zelulak edo saguaren enbrioi-ehunak Kansasko Unibertsitateko Medikuntza Zentroko mikroskopia elektronikoko zentrora eman ziren.Laburbilduz, laginak EMbed 812 erretxinan txertatu ziren (Electron Microscopy Sciences, Fort Washington, PA), gauean polimerizatu ziren 60 °C-tan, eta 80 nm-tan sekzionatu ziren diamante-xapaz hornitutako Leica UC7 ultramikrotomo bat erabiliz.Sekzioak 100 kV-ko Lab6 pistola batez hornitutako JEOL JEM-1400 transmisio-mikroskopio elektronikoa erabiliz bistaratu ziren.
Nola aipatu artikulu hau: Wilson, NR et al.SPECC1L-ren gabeziak juntura junturatuen egonkortasuna areagotzea eta garezurreko gailur neuronalaren zelulen delaminazioa murriztea dakar.zientzia.6, 17735;doi:10.1038/srep17735 (2016).
Donibane, J.-P.Gandor neuralaren indukzioa eta bereizketa.(Springer Science + Business Media; Landes Bioscience/Eurekah.com, 2006).
Cordero, DR et al.Garezurreko gandorra zelulak mugimenduan: garezurreko garapenean duten zeregina.Genetika Medikoko American Journal.A zatia 155A, 270–279, doi:10.1002/ajmg.a.33702 (2011).
Boland, RP Neurocristopathia: bere hazkundea eta garapena 20 urtean.Pediatra.patologia.laborategia.medikuntza.17, 1–25 (1997).
Mangold E., Ludwig KU eta Noten MM Breakthrough orofacial clefts genetikan.Trends in Molecular Medicine 17, 725–733, doi:10.1016/j.molmed.2011.07.007 (2011).
Minu, M. eta Riley, FM Garezurreko gandorra zelulen migrazio eta eredu molekularren garapen kraneo-fazialean.Garapena 137, 2605–2621, doi: 10.1242/dev.040048 (2010).
Dixon, MJ, Marazita, ML, Beaty, TH eta Murray, JK Cleft ezpaina eta ahosabaia: genetikoak eta ingurumen-eraginak ulertzea.iruzkin naturala.Genetika 12, 167–178, doi: 10.1038/nrg2933 (2011).
Ingram, CR et al.Larruazaleko, gorputz-adarretako eta kraneo-aurpegi-eskualdearen morfogenesia anormala interferoi erregulatzaile-faktorea-6 (Irf6) gabeziako saguetan.Genette Nazionala.38, 1335–1340, doi: 10.1038/ng1903 (2006).
Peyrard-Janvid, M. et al.GRHL3-ren mutazio nagusiek van der Waord sindromea eragiten dute eta ahozko peridermoaren garapena kaltetzen dute.Am J Hum Genet 94, 23–32, doi: 10.1016/j.ajhg.2013.11.009 (2014).
Harris, MJ eta Juriloff, DM Eguneratu hodi neuralak ixtean akatsak dituzten sagu mutanteen zerrenda eta hodi neuralaren itxieraren ulermen genetiko osoa lortzeko aurrera egin.Jaiotza-akatsen ikerketa.Part A, Clinical and Molecular Teratology 88, 653–669, doi: 10.1002/bdra.20676 (2010).
Fantauzzo, KA & Soriano, P. PI3K-ren bidez PDGFRalpha seinaleztapenak eskeletoaren garapenean biziraupena eta ugaltzea erregulatzen du p53-ren menpeko zelula barneko bide baten bidez.Gene Development 28, 1005–1017, doi: 10.1101/gad.238709.114 (2014).
Kopp, AJ, Green, ND eta Murdoch, JN Disheveled: hedapen konbergentearen erlazioa hodi neuralaren itxierarekin.Neurologian joerak.26, 453–455, doi: 10.1016/S0166-2236(03)00212-1 (2003).