Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.CSS laguntza mugatua duen arakatzailearen bertsioa erabiltzen ari zara.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Horrez gain, etengabeko laguntza bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe erakusten dugu.
Diapositiba bakoitzeko hiru artikulu erakusten dituzten graduatzaileak.Erabili atzeko eta hurrengo botoiak diapositibetan zehar mugitzeko, edo amaierako diapositiba kontroladorearen botoiak diapositiba bakoitzean mugitzeko.

317 Altzairu herdoilgaitzezko bobina-hodien hornitzaileak

Altzairu herdoilgaitzezko materialaren konposizio kimikoko taula

SPACA6 espermatozoideek adierazitako gainazaleko proteina bat da, ugaztunen ugalketa sexualean gametoen fusiorako funtsezkoa dena.Funtsezko eginkizun hori izan arren, PACA6ren funtzio espezifikoa gaizki ulertzen da.SPACA6-ren zelulaz kanpoko domeinuaren kristal-egitura argitzen dugu 2,2 Å-ko bereizmenarekin, lau katedun sortaz eta Ig-itxurako β-ogitartez osatutako bi domeinuko proteina agerian utziz lokailu ia-malguek elkartuta.Egitura honek IZUMO1-en antza du, gametoen fusioari lotutako beste proteina bat, eta SPACA6 eta IZUMO1 ernalketari lotutako proteinen superfamiliako kide sortzaileak dira hemen IST superfamilia deritzona.IST superfamilia bere lau helize sorta bihurrituarekin eta disulfuroarekin lotutako CXXC motibo pare batekin definitzen da egituraz.Giza proteomaren AlphaFold-en egituran oinarritutako bilaketa batek superfamilia honetako proteina-kide gehigarriak identifikatu zituen;batez ere, proteina horietako askok gametoen fusioan parte hartzen dute.SPACA6 egiturak eta IST superfamiliako beste kide batzuekin duen harremanak ugaztunen gametoen fusioari buruzko ezagutzan falta den lotura eskaintzen dute.
Giza bizitza bakoitza bi gameto haploide bereiziekin hasten da: aitaren espermatozoidearekin eta amaren obuluarekin.Espermatozoide hau hautaketa-prozesu bizi baten irabazlea da, zeinean milioika espermatozoide emakumezkoen sexu-hoditik igarotzen diren, hainbat oztopo gainditu1 eta kapazitatea jasaten baitute, eta horrek mugikortasuna eta gainazaleko osagaien prozesua hobetzen ditu2,3,4.Nahiz eta espermatozoideak eta obozitoak elkar aurkitzen, prozesua ez da oraindik amaitu.Obozitoa kumulus zelulen geruzaz eta zona pellucida izeneko hesi glikoproteiniko batez inguratuta dago, eta espermatozoideak igaro behar dira obozitoan sartzeko.Espermatozoideek gainazaleko atxikimendu molekulen eta mintzei lotutako eta jariatutako entzimen konbinazio bat erabiltzen dute azken oztopo horiek gainditzeko5.Molekula eta entzima hauek batez ere barne-mintzean eta matrize akrosomikoan gordetzen dira eta erreakzio akrosomikoan zehar espermatozoidearen kanpo-mintza lisatzen denean detektatzen dira6.Bidaia bizi honen azken urratsa espermatozoide-obulu fusio-gertaera da, zeinean bi zelulek mintzak batzen dituzte organismo diploide bakar bat izateko7.Prozesu hau giza ugalketan aitzindaria den arren, beharrezkoak diren elkarrekintza molekularrak gaizki ulertzen dira.
Gametoen ernalketaz gain, bi geruza lipidikoen fusioaren kimika sakon aztertu da.Oro har, mintz-fusioa energetikoki desegokiko prozesu bat da, eta proteina katalizatzaile batek bi mintz elkarrengana hurbiltzen dituen egitura-konformazio-aldaketa bat jasan behar du, haien jarraitasuna hautsiz eta fusioa eraginez8,9.Proteina katalizatzaile hauek fusogeno gisa ezagutzen dira eta hainbat fusio-sistematan aurkitu dira.Ostalari zeluletan birusak sartzeko beharrezkoak dira (adibidez, gp160 GIB-1ean, koronavirusen pika, hemaglutinina gripearen birusetan)10,11,12 plazenta (sinzitina)13,14,15 eta gametoak eratzen dituzten fusioak behe eukariotoetan ( HAP2/GCS1 landareetan, protistoetan eta artropodoetan) 16,17,18,19.Giza gametoentzako fusogenoak oraindik aurkitu gabe daude, nahiz eta frogatu den hainbat proteina kritikoak direla gametoen atxikipenerako eta fusiorako.Obozitoek adierazitako CD9, saguaren eta gizakien gametoen fusiorako beharrezkoa den mintz-gaineko proteina, aurkitu zuten lehena 21,22,23.Bere funtzio zehatza argi ez dagoen arren, atxikimenduaren zeregina, arrautza mikrobiloen atxikimendu-fokuen egitura eta/edo obozitoen gainazaleko proteinen lokalizazio zuzena dirudi 24,25,26.Gametoen fusiorako funtsezkoak diren bi proteina tipikoenak IZUMO127 espermatozoidearen proteina eta JUNO28 obozitoen proteina dira, eta elkarren arteko elkarketa urrats garrantzitsua da gametoen ezagutzan eta atxikimenduan fusioaren aurretik.Izumo1 knockout sagu arrak eta Juno knockout sagu emeak guztiz antzuak dira, eredu hauetan espermatozoideak espazio perivitelinoan sartzen dira baina gametoak ez dira fusionatzen.Era berean, giza in vitro ernalketa esperimentuetan gametoak anti-IZUMO1 edo JUNO27,29 antigorputzekin tratatu zirenean konfluentzia murriztu zen.
Duela gutxi, espermatozoideak adierazitako proteina talde aurkitu berri bat aurkitu da IZUMO1 eta JUNO20,30,31,32,33,34,35-en fenotipikoki antzekoak.Espermatozoidearen mintz akrosomakoarekin lotutako 6 proteina (SPACA6) ernalkuntzarako ezinbestekoa dela identifikatu da eskala handiko mutigenesiaren azterketa batean.Transgenea Spaca6 genean txertatzeak espermatozoide ez-fusibleak sortzen ditu, nahiz eta espermatozoide horiek espazio perivitelinoan infiltratu 36 .Saguetan egindako knockout azterketek baieztatu zuten Spaca6 beharrezkoa dela gametoen fusiorako 30,32 .SPACA6 barrabiletan ia esklusiboki adierazten da eta IZUMO1-en antzeko lokalizazio-eredua du, hots, espermatozoideen intimaren barruan erreakzio akrosomalaren aurretik, eta, ondoren, ekuatore-eskualdera migratzen du erreakzio akrosomalaren ondoren 30,32.Spaca6 homologoak hainbat ugaztun eta beste eukariotoetan 30 existitzen dira eta gizakiaren gametoen fusiorako duen garrantzia frogatu da SPACA6-ren aurkako erresistentziaren bidez gizakien ernalketa in vitro inhibituz 30 .IZUMO1 eta JUNO ez bezala, PACA6-ren egitura, interakzio eta funtzioaren xehetasunak ez daude argi.
Giza espermatozoideen eta ouluen fusioaren oinarrian dagoen oinarrizko prozesua hobeto ezagutzeko, familia-plangintzan eta ugalkortasun-tratamenduaren etorkizuneko garapenak informatzeko aukera emango diguna, PACA6 azterketa estruktural eta biokimikoak egin ditugu.SPACA6-ren zelulaz kanpoko domeinuaren kristal-egiturak lau sorta helikoidala (4HB) eta immunoglobulina-itxurako (Ig-antzeko) domeinu bat erakusten ditu eskualde ia-malguekin lotuta.Aurreko ikerketetan aurreikusi bezala,7,32,37 SPACA6-ren domeinu-egitura gizakiaren IZUMO1-aren antzekoa da, eta bi proteinek ezohiko motibo bat partekatzen dute: 4HB gainazal helikoide triangeluarra eta disulfuroari lotutako CXXC motibo pare bat.Gaur egun IZUMO1 eta SPACA6 gametoen fusioarekin lotutako proteinen superfamilia handiagoa eta egitura erlazionatuta definitzea proposatzen dugu.Superfamiliako ezaugarri bereziak erabiliz, AlphaFold giza proteomaren egiturazko bilaketa zehatza egin genuen, superfamilia horretako kide gehigarriak identifikatuz, gametoen fusioan eta/edo ernalkuntzan parte hartzen duten hainbat kide barne.Orain badirudi gametoen fusioarekin lotutako proteinen egiturazko tolestura eta superfamilia bat dagoela, eta gure egiturak giza gametoen fusio-mekanismoaren alderdi garrantzitsu honen mapa molekularra eskaintzen du.
SPACA6 pasabide bakarreko transmintz proteina bat da, N-loturiko glikano bat eta sei disulfuro-lotura ustezko (S1a eta S2 irudiak).Drosophila S2 zeluletan giza SPACA6 (hondarrak 27-246) zelulaz kanpoko domeinua adierazi genuen eta proteina purifikatu genuen nikel-afinitatea, katioi-trukea eta tamaina baztertzeko kromatografia erabiliz (S1b irudia).Purifikatutako PACA6 ektodomeinua oso egonkorra eta homogeneoa da.Argiaren dispertsio poligonalarekin (SEC-MALS) konbinatutako tamaina-esklusio-kromatografia erabiliz egindako analisiak 26,2 ± 0,5 kDa-ko pisu molekular kalkulatua zuen gailur bat agerian utzi zuen (S1c irudia).Hau bat dator SPACA6 ektodomeinu monomerikoaren tamainarekin, arazteko oligomerizazioa ez zela gertatu adierazten duena.Horrez gain, dikroismo zirkularra (CD) espektroskopiak α/β egitura mistoa agerian utzi zuen 51,3 °C-ko urtze-puntua (S1d,e irudia).CD espektroen dekonboluzioak % 38,6 α-helidal eta % 15,8 β-katedun elementuak agerian utzi zituen (S1d irudia).
SPACA6 ektodomeinua ausazko matrize-haziketa erabiliz kristalizatu zen38, 2,2 Å-ko bereizmeneko datu multzo bat lortuz (1. taula eta S3 irudia).Zatietan oinarritutako ordezkapen molekularra eta SAD faseko datuen konbinazioa erabiliz, egitura zehazteko bromuroaren esposizioarekin (1. taula eta S4 irudia), azken eredu findua 27-246 hondakinek osatzen dute.Egitura zehaztu zen unean, ez zegoen egitura esperimental edo AlphaFold erabilgarri.SPACA6 ektodomeinuak 20 Å × 20 Å × 85 Å neurtzen ditu, zazpi helizez eta bederatzi β-katez osatuta dago eta sei disulfuro loturen bidez egonkortutako tolesdura tertziario luzanga du (1a, b. irudia).Asn243 albo-katearen amaierako elektroi-dentsitate ahulak hondakin hori N-loturiko glikosilazio bat dela adierazten du.Egitura bi domeinuz osatuta dago: N-terminaleko lau helize sorta bat (4HB) eta C-terminaleko Ig antzeko domeinu bat, bien artean tarteko bisagra eskualde bat duena (1c. irudia).
a PACA6-ren zelulaz kanpoko domeinuaren egitura.SPACA6-ren zelulaz kanpoko domeinuaren zerrenda-diagrama, N-tik C-muturrerako katearen kolorea urdin ilunetik gorri ilunera.Lotur disulfuroetan parte hartzen duten zisteinak magenta nabarmentzen dira.b SPACA6-ren zelulaz kanpoko domeinuaren topologia.Erabili 1a irudiko kolore-eskema bera.c SPANA6 domeinuaz kanpoko domeinua.4HB, bisagra eta Ig antzeko domeinu-zerrenda grafikoak laranja, berdea eta urdina dira, hurrenez hurren.Geruzak ez dira eskalara marrazten.
SPACA6-ren 4HB domeinuak lau helize nagusi biltzen ditu (1-4 helizeak), helize helize baten moduan antolatuta (2a irudia), elkarreragin antiparalelo eta paraleloen artean txandakatuz (2b irudia).Bira bakarreko helize gehigarri txiki bat (helizea 1′) sortaren perpendikularra jartzen da, 1 eta 2 helizeekin triangelu bat osatuz. Triangelu hau apur bat deformatuta dago 3. eta 4. helizeen bilketa trinko samarraren helize-bihurritutako paketean ( 2a irudia).
4HB N-terminalaren diagrama.b Lau helizeko sorta baten goiko ikuspegia, helize bakoitza urdin ilunez nabarmenduta N muturrean eta gorri ilunean C muturrean.c 4HBrako goitik beherako gurpil espiralaren diagrama, hondakin bakoitza letra bakarreko aminoazido-kode batekin etiketatutako zirkulu gisa ageri da;gurpilaren goiko aldean dauden lau aminoazidoak bakarrik daude zenbatuta.Hondakin ez-polarrek horiz margotzen dute, kargarik gabeko hondakin polarrek berdez, positiboki kargatutako hondakinek urdinez eta negatiboki kargatutako hondakinek gorriz.d 4HB domeinuko aurpegi triangeluarrak, 4HBak laranja kolorekoak eta gontzak berdez.Bi txertatzeek haga formako disulfuro loturak erakusten dituzte.
4HB hondar alifatiko eta aromatikoz osatutako barne-nukleo hidrofobiko batean kontzentratzen da (2c. irudia).Nukleoak Cys41 eta Cys55 arteko lotura disulfuro bat dauka, 1 eta 2 helizeak elkarrekin lotzen dituen goiko triangelu goratu batean (2d. irudia).Helix 1′-ko CXXC motiboaren eta bisagra eskualdeko β-ilaren puntan aurkitutako beste CXXC motibo baten artean bi disulfuro lotura gehigarri sortu ziren (2d. irudia).Funtzio ezezaguna duen arginina hondakin kontserbadorea (Arg37) 1′, 1 eta 2 helizeek osatutako triangelu huts baten barruan dago. Cβ, Cγ eta Cδ karbono atomo alifatikoek Arg37 nukleo hidrofobikoarekin elkarreragiten dute, eta bere guanidina taldeak ziklikoki mugitzen dira. 1′ eta 1 helizeen artean Thr32 bizkarrezurra eta alboko katearen arteko elkarreraginen bidez (S5a,b irudia).Tyr34 barrunbean hedatzen da bi barrunbe txiki utziz Arg37 disolbatzailearekin elkarreragiteko.
Ig-itxurako β-ogitarteko domeinuak nukleo hidrofobiko baten bidez elkarreragiten duten kate anitzeko β-orri anfipatiko bi edo gehiagoren ezaugarri komuna partekatzen duten proteina-superfamilia handi bat dira 39. SPACA6-ren C-terminalaren Ig-itxurako domeinuak eredu bera du. eta bi geruzaz osatuta dago (S6a. irud.).1. orria lau hariz osatutako β xafla bat da (D, F, H eta I kateak) non F, H eta I kateek paraleloaren aurkako antolamendua osatzen duten eta I eta D kateek elkarrekintza paraleloa hartzen duten.2. taula hari bikoitzeko beta xafla txiki bat da (E eta G kateak).Barne disulfuro-lotura bat ikusi zen E katearen C-muturraren eta H katearen (Cys170-Cys226) zentroaren artean (S6b. irudia).Lotura disulfuro hau immunoglobulinaren β-sandwich domeinuko disulfuro loturaren antzekoa da40,41.
Lau haridun β xaflak bere luzera osoan bihurritzen du, forma eta elektrostatika desberdina duten ertz asimetrikoak osatuz.Ertz meheagoa ingurune hidrofobiko lau bat da, eta SPACA6-ko gainerako gainazal irregular eta elektrostatikoki anitzekin alderatuta nabarmentzen da (S6b,c irudia).Agerian dauden bizkarrezurreko karbonilo/amino taldeen eta albo-kate polarren halo batek gainazal hidrofoboa inguratzen du (S6c. irudia).Marjina zabalagoa nukleo hidrofobikoaren N-terminalaren zatia blokeatzen duen eta F katearen bizkarrezurreko talde polar irekiarekin hiru hidrogeno-lotura eratzen dituen segmentu helikoidala estalita dago (S6d. irudia).Ertz honen C-terminalaren zatiak poltsiko handi bat osatzen du, partzialki agerian dagoen nukleo hidrofobiko batekin.Poltsikoa karga positiboz inguratuta dago arginina-hondakin bikoitz (Arg162-Arg221, Arg201-Arg205 eta Arg212-Arg214) eta erdiko histidina (His220) (S6e irudia) hiru multzoren ondorioz.
Bisagra eskualdea domeinu helikoidalaren eta Ig antzeko domeinuaren arteko segmentu labur bat da, hiru kate β-geruza bat (A, B eta C kateak), 310 helize txiki bat eta ausazko helize-segmentu luze ugariz osatua.(S7. irudia).Bisagra eskualdeko kontaktu kobalente eta elektrostatikoen sare batek 4HB eta Ig antzeko domeinuaren arteko orientazioa egonkortzen duela dirudi.Sarea hiru zatitan bana daiteke.Lehenengo zatiak bi CXXC motibo biltzen ditu (27CXXC30 eta 139CXXC142), bisagrako β-ilaren eta 4HBko 1′ helizearen artean disulfuro-lotura pare bat osatzen dutenak.Bigarren zatiak Ig antzeko domeinuaren eta bisagraren arteko interakzio elektrostatikoak biltzen ditu.Bisagran Glu132-k gatz-zubi bat osatzen du Arg233-rekin Ig-antzeko domeinuan eta Arg135-ekin bisagran.Hirugarren zatiak Ig antzeko domeinuaren eta bisagra eskualdearen arteko lotura kobalentea biltzen du.Bi disulfuro loturak (Cys124-Cys147 eta Cys128-Cys153) bisagra begizta Gln131 eta bizkarrezurreko talde funtzionalaren arteko interakzio elektrostatikoen bidez egonkortzen den lokailu batera lotzen dute, lehen Ig-antzeko domeinura sarbidea ahalbidetuz.katea.
PACA6 ektodomeinuaren egitura eta 4HB eta Ig antzeko domeinuen egitura indibidualak erabili ziren proteina datu-baseetan egiturazko antzeko erregistroak bilatzeko 42 .Dali Z puntuazio altuekin, desbideratze estandar txikiekin eta LALI puntuazio handiekin (azken hau egituraz baliokide diren hondakinen kopurua da).Ektodomeinuaren bilaketa osoko lehen 10 hits (S1 taula) Z-puntuazio onargarria > 842 izan arren, 4HB edo Ig antzeko domeinuaren bilaketak bakarrik erakutsi zuen arrakasta horietako gehienak β-ogitarteei soilik zeudela.proteina askotan aurkitzen den nonahiko tolesdura.Daliko hiru bilaketak emaitza bakarra eman dute: IZUMO1.
Aspalditik iradoki da PACA6 eta IZUMO1 egiturazko antzekotasunak partekatzen dituztela7,32,37.Gametoen fusioarekin lotutako bi proteina hauen ektodomeinuek % 21eko sekuentzia-identitatea baino ez duten arren (S8a irudia), ebidentzia konplexuak, kontserbatutako disulfuro-lotura-eredua eta C-terminaleko Ig antzeko domeinua aurreikusitako SPACA6-n barne, saiakera goiztiarrak ahalbidetu zituzten. A sPACA6 sagu baten homologia eredua IZUMO1 txantiloi gisa erabiliz37.Gure egiturak iragarpen hauek berresten ditu eta benetako antzekotasun maila erakusten du.Izan ere, SPACA6 eta IZUMO137,43,44 egiturek bi domeinuko arkitektura bera partekatzen dute (S8b. irud.) 4HB eta Ig antzeko β-sandwich domeinuekin gontz-eskualde batez konektatuta (S8c. irudia).
IZUMO1 eta PACA6 4HB-k ohiko sorta espiralekiko desberdintasun komunak dituzte.4HB tipikoek, fusio endosomikoan parte hartzen duten SNARE proteina-konplexuetan aurkitzen direnek bezala 45,46, erdiko ardatz baten inguruan kurbadura konstantea mantentzen duten 47 helize uniformeki banatuak dituzte. Aitzitik, IZUMO1 eta SPACA6-n domeinu helikoideak distortsionatu egin ziren, kurbadura aldakorrarekin eta paketatze irregularra (S8d irudia).Bihurketa, ziurrenik 1′, 1 eta 2 helizeek osatutako triangeluak eragindakoa, IZUMO1 eta SPACA6-n mantentzen da eta CXXC motibo berberarekin egonkortzen da 1′ helizean.Hala ere, SPACA6-n aurkitutako disulfuro-lotura gehigarriak (goiko 1. eta 2. helizeak kobalenteki lotzen dituzten Cys55) erpin zorrotzagoa sortzen du triangeluaren erpinean, eta SPACA6 IZUMO1 baino bihurrituagoa da, barrunbe-triangelu nabarmenagoekin.Horrez gain, IZUMO1ek SPACA6-n barrunbe honen erdian ikusitako Arg37 falta du.Aitzitik, IZUMO1ek hondar alifatiko eta aromatikoen nukleo hidrofobo tipikoagoa du.
IZUMO1-ek Ig-itxurako domeinua du kate bikoitzeko eta bost kateko β-orri batez osatua43.IZUMO1-eko hari gehigarriak SPACA6-ko bobina ordezkatzen du, F katearekin elkarreragiten duen katearen bizkarrezurreko hidrogeno-loturak mugatzeko.Konparaketa puntu interesgarri bat bi proteinen Ig antzeko domeinuen gainazaleko karga aurreikusia da.IZUMO1 gainazala sPACA6 gainazala baino negatiboki kargatuta dago.Karga gehigarri bat espermatozoidearen mintzarekiko dagoen C-muturretik gertu dago.SPACA6-n, eskualde berdinak neutroagoak edo positiboki kargatuta zeuden (S8e. irudia).Adibidez, SPACA6-n gainazal hidrofoboa (ertz meheak) eta positiboki kargatutako hobiak (ertz zabalagoak) negatiboki kargatuta daude IZUMO1en.
IZUMO1 eta SPACA6-ren arteko erlazioa eta egitura sekundarioko elementuak ondo kontserbatuta dauden arren, Ig antzeko domeinuen egitura-lerrokatzeak erakutsi zuen bi domeinuak elkarren arteko orientazio orokorrean desberdinak direla (S9. irudia).IZUMO1-en sorta espirala β-ogitartekoaren inguruan kurbatuta dago, lehen deskribatutako "boomerang" forma erdiko ardatzetik 50° ingurura sortuz.Aitzitik, SPACA6-ko habe helikoidala 10° inguru okertu zen kontrako norabidean.Orientazio horien desberdintasunak bisagra-eskualdearen aldeak direla eta.Sekuentzia maila primarioan, IZUMO1 eta SPACA6-k sekuentzia-antzekotasun txikia dute bisagran, zisteina, glizina eta azido aspartiko hondakinak izan ezik.Ondorioz, hidrogeno-loturak eta sare elektrostatikoak guztiz desberdinak dira.β-orriaren egitura sekundarioko elementuak IZUMO1 eta SPACA6-k partekatzen dituzte, nahiz eta IZUMO1-en kateak askoz luzeagoak diren eta 310 helizea (5. helizea) SPACA6-n bakarra den.Desberdintasun hauek domeinu-orientazio desberdinak eragiten dituzte bestela antzekoak diren bi proteinentzat.
Gure Dali zerbitzariaren bilaketak agerian utzi zuen SPACA6 eta IZUMO1 proteina datu-basean esperimentalki zehaztutako bi egitura bakarrak direla 4HB tolestura jakin hori dutenak (S1 taula).Duela gutxi, DeepMind-ek (Alphabet/Google) AlphaFold garatu du, sekuentzia primarioetatik proteinen 3D egiturak zehaztasunez aurreikus ditzakeen sare neuronalean oinarritutako sistema48.SPACA6 egitura konpondu eta gutxira, AlphaFold datu-basea kaleratu zen, giza proteomako proteina guztien % 98,5 estaltzen duten egitura iragarle-ereduak eskainiz48,49.Gure ebatzitako SPACA6 egitura bilaketa-eredu gisa erabiliz, AlphaFold giza proteoman ereduaren homologia estrukturalaren bilaketak SPACA6 eta IZUMO1-en egitura-antzekotasun posibleak zituzten hautagaiak identifikatu zituen.AlphaFold-ek SPACA6 iragartzeko duen zehaztasun ikaragarria ikusita (S10a irud.) —batez ere 1,1 Å rms ektodomeinua gure ebatzitako egiturarekin alderatuta (S10b. irudia)— ziur egon gaitezke identifikatutako SPACA6 partidak zehatzak izango direla.
Aurretik, PSI-BLASTek IZUMO1 multzoa bilatu zuen espermatozoideekin lotutako beste hiru proteinekin: IZUMO2, IZUMO3 eta IZUMO450.AlphaFold-ek iragarri zuen IZUMO familiako proteina hauek 4HB domeinuan tolesten direla IZUMO1-en disulfuro-lotura-eredu berarekin (3a eta S11 irudiak), nahiz eta Ig antzeko domeinurik ez duten.IZUMO2 eta IZUMO3 IZUMO1-en antzeko mintz proteinak direla hipotesia da, IZUMO4 jariatuta dagoela dirudi.Gametoen fusioan IZUMO 2, 3 eta 4 proteinen funtzioak ez dira zehaztu.Jakina da IZUMO3-k espermatozoideen garapenean akrosomaren biogenesian zeregina duela51, eta IZUMO proteinak konplexu bat eratzen du50.IZUMO proteinen kontserbazioak ugaztun, narrasti eta anfibioetan iradokitzen du haien funtzio potentziala koherentea dela gameto-fusioarekin lotutako beste proteina ezagun batzuekin, hala nola DCST1/2, SOF1 eta FIMPekin.
IST superfamiliaren domeinu-arkitekturaren diagrama, 4HB, bisagra eta Ig-itxurako domeinuak laranjaz, berdez eta urdinez nabarmenduta, hurrenez hurren.IZUMO4-k beltz itxura duen C-terminal eskualde berezia du.Lotura disulfuro baieztatuak eta ustezkoak marra solidoen eta puntudunen bidez adierazten dira, hurrenez hurren.b IZUMO1 (PDB: 5F4E), SPACA6, IZUMO2 (AlphaFold DB: AF-Q6UXV1-F1), IZUMO3 (AlphaFold DB: AF-Q5VZ72-F1), IZUMO4 (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) eta (AlphaFold DB: AF-Q1ZYL8-F1) DB: AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q1ZYL8-F1) : AF-Q3KNT9-F1) A panelaren kolore-barruti berean bistaratzen dira. Disulfuro loturak magentaz erakusten dira.TMEM95, IZUMO2 eta IZUMO3 transmintz-helizeak ez dira erakusten.
IZUMO proteina ez bezala, beste SPACA proteinak (hau da, SPACA1, SPACA3, SPACA4, SPACA5 eta SPACA9) egituraz desberdinak direla uste da SPACA6 (S12. irudia).SPACA9-k bakarrik du 4HB, baina ez da espero SPACA6-ren paralelo-kontrako orientazio bera edo disulfuro-lotura bera izatea.SPACA1ek bakarrik dauka antzeko Ig antzeko domeinua.AlphaFoldek aurreikusten du SPACA3, SPACA4 eta SPACA5 egitura guztiz ezberdina dutela SPACA6.Interesgarria da SPACA4-k ere ernalketan zeresana duela, baina SPACA6-k baino neurri handiagoan, espermatozoideen eta obozitoen zona pellucidaren arteko elkarrekintza errazten duelarik52.
Gure AlphaFold bilaketak IZUMO1 eta SPACA6 4HB, TMEM95-ren beste pareko bat aurkitu du.TMEM95, espermatozoidearen transmintz-proteina espezifiko bakarrak, sagu arrak antzu bihurtzen ditu ablazioan 32,33.TMEM95 ez zuten espermatozoideek morfologia, mugikortasuna eta zona pellucidan barneratzeko eta arrautza-mintzari lotzeko gaitasuna zuten, baina ezin zuten obozitoen mintzarekin fusionatu.Aurretik egindako ikerketek erakutsi dute TMEM95ek egiturazko antzekotasunak partekatzen dituela IZUMO133rekin.Izan ere, AlphaFold ereduak baieztatu zuen TMEM95 4HB bat dela, IZUMO1 eta SPACA6-ren CXXC motibo pare berdinarekin eta SPACA6-n aurkitutako 1. eta 2. helizeen arteko disulfuro-lotura osagarri bera duena (3a eta S11. irudia).TMEM95-ek Ig antzeko domeinurik ez badu ere, SPACA6 eta IZUMO1 bisagra eskualdeen antzeko disulfuro-lotura-eredua duen eskualde bat du (3b. irudia).Eskuizkribu hau argitaratu zenean, aurreinprimaketa zerbitzariak TMEM95-en egituraren berri eman zuen, AlphaFold53 emaitza baieztatuz.TMEM95 SPACA6 eta IZUMO1-en oso antzekoa da eta ebolutiboki kontserbatuta dago jada anfibioetan (4. eta S13. irudiak).
PSI-BLAST bilaketak NCBI SPACA6, IZUMO1-4, TMEM95, DCST1, DCST2, FIMP eta SOF1 datu-baseak erabili zituen sekuentzia horien posizioa biziaren zuhaitzean zehazteko.Adarren puntuen arteko distantziak ez dira eskalan erakusten.
SPACA6 eta IZUMO1-en arteko egitura-antzekotasun orokorrak iradokitzen du TMEM95 eta IZUMO 2, 3 eta 4 proteinak barne hartzen dituen superfamilia estruktural kontserbatu bateko kide sortzaileak direla.kideak ezagunak: IZUMO1, SPACA6 eta TMEM95.Kide gutxi batzuek Ig antzeko domeinuak dituztenez, IST superfamiliaren bereizgarria 4HB domeinua da, zeinak proteina hauen guztien ezaugarri bereziak dituena: 1) 4HB harilkatua alternantzia antiparalelo/paraleloan antolatutako helizeekin (Irudia. . 5a), 2) sortak sortaren barruan bi helizez eta hirugarren helize bertikal batez osatutako aurpegi triangeluarra du (Irudia gako-eremua (5c. Irudia). Tioredoxina-itxurako proteinetan aurkitzen den CXXC motiboak funtzionatzen duela jakina da. redox sentsore gisa 54,55,56, IST familiako kideen motiboa gametoen fusioan ERp57 bezalako proteina disulfuro isomerasekin lotu daiteke.Rolak daude lotuta 57,58.
IST superfamiliako kideak 4HB domeinuaren hiru ezaugarri bereizgarrik definitzen dituzte: orientazio paraleloaren eta paraleloaren aurkako lau helizeak txandakatuz, ba-triangelu-sorta helikoidaleko aurpegiak eta molekula txikien artean eratutako ca CXXC motibo bikoitz bat.) N-terminalaren helizeak (laranja) eta bisagra-eskualdea β-ile-horntza (berdea).
SPACA6 eta IZUMO1-en arteko antzekotasuna ikusita, lehenak IZUMO1 edo JUNOrekin lotzeko duen gaitasuna probatu zen.Biogeruzako interferometria (BLI) IZUMO1 eta JUNOren arteko elkarrekintza kuantifikatzeko erabili izan den lotura-metodo zinetikoa da.IZUMO1 biotinaz markatutako sentsorea JUNO analitoaren kontzentrazio handia duen beita gisa inkubatu ondoren, seinale indartsu bat detektatu zen (S14a. irudia), sentsorearen puntan atxikitako biomaterialaren lodieraren lodieraren lodieraren aldaketa adierazten duena.Antzeko seinaleak (hau da, JUNO sentsoreari akoplatua IZUMO1 analitoaren aurkako beita gisa) (S14b. irudia).Ez zen seinalerik hauteman SPACA6 sentsoreari loturiko IZUMO1 edo sentsoreari loturiko JUNOren aurkako analito gisa erabili zenean (S14a,b irudia).Seinale hori ez egoteak adierazten du SPACA6-ren zelula kanpoko domeinuak ez duela elkarreragiten IZUMO1 edo JUNO-ren zelulaz kanpoko domeinuarekin.
BLI saiakera beita-proteinaren lisina-hondar askeen biotinilazioan oinarritzen denez, aldaketa honek lotura eragotzi dezake interakzioan lisina-hondarrak parte hartzen badute.Gainera, sentsorearekiko loturaren orientazioak oztopo esterikoak sor ditzake, beraz, ohiko pull-down saiakuntzak ere egin ziren SPACA6, IZUMO1 eta JUNO ektodomeinu birkonbinatzaileetan.Hala eta guztiz ere, SPACA6-k ez zuen hauspeatu His-eko IZUMO1 edo His-eko JUNO-rekin (S14c,d irud.), BLI esperimentuetan ikusitakoarekin bat datorren interakziorik ez dagoela adieraziz.Kontrol positibo gisa, JUNO-ren elkarrekintza baieztatu dugu His IZUMO1 etiketatuarekin (S14e eta S15 irudiak).
SPACA6 eta IZUMO1-en egiturazko antzekotasuna izan arren, SPACA6-k JUNO lotzeko ezintasuna ez da harritzekoa.Giza IZUMO1 gainazalean JUNOrekin elkarreraginean dauden 20 hondakin baino gehiago daude, hiru eskualdeetako hondarrak barne (nahiz eta gehienak bisagra eskualdean egon) (S14f. irudia).Hondakin horietatik, bakarra kontserbatzen da PACA6-n (Glu70).Hondakin-ordezkapen askok jatorrizko propietate biokimikoak mantendu zituzten arren, IZUMO1-en Arg160 hondakin ezinbestekoa SPACA6-n negatiboki kargatutako Asp148rekin ordezkatu zen;aurreko ikerketek erakutsi dute IZUMO1-en Arg160Glu mutazioak ia erabat ezabatzen duela JUNO43arekiko lotura.Horrez gain, IZUMO1 eta SPACA6-ren arteko domeinu-orientazioaren aldeak nabarmen handitu zuen SPACA6-ko eskualde baliokidearen JUNO-lotura-gunearen azalera (S14g. irudia).
Gametoen fusiorako SPACA6-ren beharra ezagutu arren eta IZUMO1-ekin duen antzekotasuna izan arren, SPACA6-k ez dirudi JUNO lotura-funtzio baliokiderik duenik.Hori dela eta, gure egiturazko datuak biologia ebolutiboak emandako garrantziaren ebidentziarekin uztartu nahi izan ditugu.SPACA6 homologoen sekuentzia lerrokatzeak ugaztunetatik haratago egitura komunaren kontserbazioa erakusten du.Adibidez, zisteina-hondarrak urrutiko erlazionatutako anfibioetan ere agertzen dira (6a. irudia).ConSurf zerbitzaria erabiliz, 66 sekuentziaren sekuentziaren lerrokatze-atxikipen-datuak SPACA6 gainazalean mapatu ziren.Azterketa mota honek proteinen bilakaeran zehar zein hondakin kontserbatu diren ikus dezake eta azaleko eskualdeek funtzioan zeresana duten adieraz dezakete.
a CLUSTAL OMEGA erabiliz prestatutako 12 espezie ezberdinetako PACA6 ektodomeinuen sekuentzia lerrokatzea.ConSurf analisiaren arabera, posizio kontserbadoreenak urdinez markatzen dira.Zisteina-hondarrak gorriz nabarmentzen dira.Domeinu-mugak eta bigarren mailako egitura-elementuak lerrokaduraren goiko aldean erakusten dira, non geziek β-kateak eta uhinek helizeak adierazten dituzten.Sekuentziak dituzten NCBI Sarbide-identifikatzaileak honako hauek dira: gizakia (Homo sapiens, NP_001303901), mandrila (Mandrilus leucophaeus, XP_011821277), tximino kaputxinoa (Cebus mimic, XP_017359366), zaldia (Equus caballus), killer (Equus caballus, XP_02023) XP_032_034) .), ardiak (Ovis aries, XP_014955560), elefantea (Loxodonta africana, XP_010585293), txakurra (Canis lupus familyis, XP_025277208), sagua (Mus musculus, NP_001156381), Tasmaniako deabrua (Sar11, XP_03), XP_03, XP_03 8) , 61_89 eta Bullfrog (Bufo bufo, XP_040282113).Zenbaketa giza ordenan oinarritzen da.b SPACA6 egituraren gainazaleko irudikapena 4HB goialdean eta Ig antzeko domeinua behean, koloreak ConSurf zerbitzariaren kontserbazio estimazioetan oinarrituta.Hobeen kontserbatzen diren zatiak urdinez daude, neurriz kontserbatutakoak zuriz eta gutxien kontserbatzen direnak horiz.zisteina morea.Babes maila altua erakusten duten gainazaleko hiru adabaki erakusten dira 1., 2. eta 3. adabaki etiketatuetan. 4HBko marrazki bizidun bat ageri da goiko eskuineko txertatuan (kolore-eskema bera).
SPACA6 egiturak oso kontserbatutako hiru azalera-eskualde ditu (6b. irudia).1. adabakiak 4HB eta bisagra eskualdea hartzen ditu eta bi CXXC disulfuro zubi kontserbatu ditu, Arg233-Glu132-Arg135-Ser144 bisagra sare bat (S7. irudia) eta kanpoko hiru hondakin aromatiko kontserbatu (Phe31, Tyr73, Phe137)).Ig-antzeko domeinuaren ertz zabalagoa (S6e. irudia), espermatozoideen gainazalean positiboki kargatutako hainbat hondakin adierazten dituena.Interesgarria da adabaki honek antigorputz epitopo bat duela, eta lehenago frogatu dena SPACA6 30 funtzioa oztopatzen duela.3. eskualdeak Ig-itxurako domeinuaren bisagra eta alde bat hartzen ditu;eskualde honek kontserbatutako prolinak (Pro126, Pro127, Pro150, Pro154) eta kanpora begira dauden hondakin polarrak/kargatuak ditu.Harrigarria bada ere, 4HBren gainazaleko hondakin gehienak oso aldakorrak dira (6b. irudia), nahiz eta tolestura SPACA6 homologoan zehar kontserbatzen den (sorta hidrofobikoaren nukleoaren kontserbadurismoak adierazten duen bezala) eta IST superfamiliatik haratago.
Nahiz eta SPACA6-ko eskualderik txikiena detekta daitekeen egitura sekundarioko elementu gutxien dituena, bisagra-eskualdearen aztarna asko (3. eskualdea barne) oso kontserbatuta daude SPACA6 homologoen artean, eta horrek sorta helikoidearen eta β-ogitartekoaren orientazioak zeresan handia duela adieraz dezake.kontserbadore gisa.Hala eta guztiz ere, SPACA6 eta IZUMO1-en bisagra eskualdean hidrogeno-lotura eta sare elektrostatiko zabalak izan arren, malgutasun intrintsekoaren froga ikus daiteke IZUMO137,43,44-en baimendutako hainbat egituraren lerrokaduran.Banakako domeinuen lerrokadura ondo gainjartzen zen, baina domeinuen orientazioa elkarren artean 50°-tik 70°-ra aldatu zen erdiko ardatzetik (S16. irudia).SPACA6-ren konformazio-dinamika disoluzioan ulertzeko, SAXS esperimentuak egin ziren (S17a,b. irudia).SPACA6 ektodomeinuaren ab initio berreraikuntza haga kristalezko egitura batekin moldatu zen (S18. irud.), nahiz eta Kratky lursailak nolabaiteko malgutasuna erakutsi (S17b. irudia).Konformazio honek IZUMO1ekin kontrajartzen du, non lotu gabeko proteinak boomerang forma hartzen baitu sarean zein disoluzioan43.
Eskualde malgua zehazki identifikatzeko, hidrogeno-deuterio trukerako masa-espektroskopia (H-DXMS) egin zen SPACA6-n eta aldez aurretik IZUMO143-n lortutako datuekin alderatu zen (7a,b irudiak).SPACA6 argi eta garbi IZUMO1 baino malguagoa da, 100.000 s trukearen ondoren egitura osoan deuterio-truke handiagoak adierazten duenez.Bi egituretan, bisagra-eskualdearen C-terminalak truke-maila handia erakusten du, eta horrek ziurrenik 4HB eta Ig antzeko domeinuen biraketa mugatua ahalbidetzen du elkarren artean.Interesgarria da, 147CDLPLDCP154 hondakinez osatuta dagoen SPACA6 bisagraren C-terminalaren zatia 3. eskualde oso kontserbatua da (6b. irudia), ziurrenik domeinuen arteko malgutasuna SPACA6ren eboluziorako kontserbatutako ezaugarri bat dela adierazten duena.Malgutasun-analisiaren arabera, CD-ko urtze termikoko datuek SPACA6 (Tm = 51,2 °C) IZUMO1 (Tm = 62,9 °C) baino egonkorragoa dela erakutsi dute (S1e eta S19. irudiak).
a SPACA6 eta b IZUMO1 irudiak H-DXMS.Deuterio-truke ehunekoa adierazitako denbora-puntuetan zehaztu zen.Hidrogeno-deuterio truke-mailak kolore bidez adierazten dira urdinetik (% 10) gorritik (% 90) gradiente batean.Kutxa beltzek truke handiko eremuak adierazten dituzte.Kristal-egituran ikusitako 4HB, bisagra eta Ig antzeko domeinuaren mugak sekuentzia primarioaren gainean erakusten dira.10 s, 1000 s eta 100.000 s-ko deuterio-truke-mailak SPACA6 eta IZUMO1-en gainazal molekular gardenetan gainjarritako zerrenda-diagrama batean marraztu ziren.%50etik beherako deuterio-truke-maila duten egituren zatiak zuri kolorekoak dira.H-DXMS trukearen %50etik gorako eremuak gradiente-eskala batean koloreztatuta daude.
CRISPR/Cas9 eta saguaren geneen knockout estrategia genetikoen erabilerak espermatozoideak eta ouluak lotzeko eta fusiorako garrantzitsuak diren hainbat faktore identifikatu ditu.IZUMO1-JUNO eta CD9 egituraren ondo ezaugarritutako elkarrekintzaz gain, gametoen fusioarekin lotutako proteina gehienak egituralki eta funtzionalki enigmatiko geratzen dira.SPACA6-ren karakterizazio biofisikoa eta estrukturala ernalkuntzan zehar atxikimendu/fusio molekular puzzlearen beste pieza bat da.
SPACA6 eta IST superfamiliako beste kide batzuk oso kontserbatuta daudela dirudi ugaztunetan, baita hegazti, narrasti eta anfibio indibidualetan ere;izan ere, uste da sPACA6 ere beharrezkoa dela ernaltzeko zebra-arrainetan 59. Banaketa hau gametoen fusioarekin lotutako beste proteina ezagun batzuen antzekoa da, hala nola DCST134, DCST234, FIMP31 eta SOF132, faktore horiek HAP2 eskasak direla (ere GCS1 izenez ezagutzen diren proteinak, protista askoren jarduera katalitikoaz arduratzen direnak., landareak eta artropodoak.Ernaldutako fusio-proteinak 60, 61. SPACA6 eta IZUMO1-en arteko egitura-antzekotasun handia izan arren, proteina hauetako bat kodetzen duten geneen kanporaketak antzutasuna eragin zuen sagu arrak, gametoen fusioan dituzten funtzioak ez direla bikoiztu adieraziz..Orokorrean, fusioaren atxikimendu faserako beharrezkoak diren espermatozoide proteina ezagunetako bat ere ez da soberan.
Galdera irekia geratzen da SPACA6k (eta IST superfamiliako beste kide batzuek) elkargune intergametikoetan parte hartzen duten, sare intragametikoak osatzen dituzten proteina garrantzitsuak fusio-puntuetara biltzeko edo, agian, fusogeno iheskor gisa jokatzen duten.HEK293T zeluletan ko-immunoprezipitazio ikerketek IZUMO1 eta SPACA632 luzera osoko elkarrekintza agerian utzi zuten.Hala ere, gure ektodomeinu birkonbinatzaileek ez zuten in vitro elkarreragin, Noda et al-en ikusitako elkarrekintzak iradokitzen du.biak ezabatu ziren eraikuntzan (kontuan izan IZUMO1-en buztan zitoplasmatikoa, ernalkuntzarako beharrezkoa ez dena62).Bestela, IZUMO1 eta/edo SPACA6 in vitro erreproduzitzen ez ditugun lotura-ingurune espezifikoak behar ditzakete, hala nola, fisiologikoki espezifikoak diren konformazioak edo beste proteina batzuk dituzten konplexu molekularrak (ezagunak edo oraindik aurkitu gabeak).IZUMO1 ektodomeinuak espermatozoideen arrautza espazio perivitelinoan atxikitzeko bitartekaria dela uste bada ere, ez dago argi SPACA6 ektodomeinuaren helburua.
PACA6-ren egiturak proteina-proteina elkarrekintzetan parte hartu dezaketen hainbat gainazal kontserbatu erakusten ditu.CXXC motiboaren ondoan dagoen bisagra-eskualdearen kontserbatutako zatiak (goian 1. adabaki izendatua) kanpoaldera begira dauden hainbat hondakin aromatiko ditu, biomolekulen arteko interakzio hidrofobo eta π-pilaketarekin lotzen direnak.Ig antzeko domeinuaren alde zabalek (2. eskualdea) positiboki kargatutako zirrikitu bat osatzen dute oso kontserbatuta dauden Arg eta His hondakinekin, eta eskualde honen aurkako antigorputzak erabili izan dira gametoen fusioa blokeatzeko 30 .Antigorputzak 212RIRPAQLTHRGTFS225 epitopo lineala ezagutzen du, sei arginina-hondaretatik hiru eta oso kontserbatua den His220 dituena.Ez dago argi disfuntzioa hondar espezifiko horien blokeoagatik edo eskualde osoagatik den.Hutsune horren kokapenak β-ogitartekoaren C-muturretik gertu egoteak ondoko espermatozoideen proteinekin cis-interakzioak adierazten ditu, baina ez obozito-proteinekin.Gainera, prolinaz aberatsa den nahasketa oso malgu bat (3. gunea) gontzaren barruan atxikitzea proteina-proteina elkarrekintzaren gunea izan daiteke edo, litekeena da, bi domeinuen arteko malgutasunaren atxikipena adieraztea.Generoa garrantzitsua da PACA6ren rol ezezagunerako.gametoen fusioa.
SPACA6-k zelulen arteko atxikimendu-proteinen propietateak ditu, Ig antzeko β-ogitartekoak barne.Proteina itsasgarri askok (adibidez, kadherinak, integrinak, adhesinak eta IZUMO1) β-ogitarteko domeinu bat edo gehiago dituzte, proteinak zelularen mintzetik ingurumen-helburuetara hedatzen dituztenak63,64,65.SPACA6-ren Ig antzeko domeinuak atxikimendu- eta kohesio-ogitarteko β-etan aurkitu ohi den motibo bat ere badu: β-ogitartekoen muturretan dauden kate paraleloen bikoteak, clamps mekaniko gisa ezagutzen direnak66.Uste da motibo honek ebakidura-indarren erresistentzia areagotzen duela, eta hori baliotsua da zelulen arteko elkarrekintzetan parte hartzen duten proteinentzat.Hala ere, adhesinekin antzekotasun hori izan arren, gaur egun ez dago frogarik PACA6-k arrautza zuringoekin elkarreragiten duenik.SPACA6 ektodomeinua ezin da JUNOrekin lotu, eta sPACA6 adierazten duten HEK293T zelulek, hemen erakusten den bezala, ez dute ia interakzioan 32 zonarik ez duten obozitoekin.PACA6-k lotura intergametikoak ezartzen baditu, interakzio horiek itzulpen osteko aldaketak edo egonkortzea eskatu dezakete beste espermatozoideen proteina batzuek.Azken hipotesiaren alde, IZUMO1 eskaseko espermatozoideak obozitoetara lotzen dira, eta IZUMO1 ez diren molekulek gametoen atxikimendu-urratsean 27 parte hartzen dutela frogatuz.
Fusio-proteina biral, zelular eta garapen-proteina askok fusogeno gisa duten funtzioa iragartzen duten propietateak dituzte.Esaterako, fusio-glikoprotein birikoak (I, II eta III klaseak) ostalariaren mintzean txertatzen den proteinaren amaieran fusio-peptido edo begizta hidrofobiko bat dute.IZUMO143-ren hidrofilia-mapak eta IST superfamiliaren egiturak (zehaztuta eta aurreikusita) ez zuten ageriko fusio-peptido hidrofobikorik erakutsi.Hortaz, IST superfamiliako proteinak fusogeno gisa funtzionatzen badu, beste adibide ezagun batzuen modu ezberdinean egiten du.
Ondorioz, gametoen fusioarekin lotutako IST superfamiliako proteinen funtzioak misterio erakargarri bat izaten jarraitzen du.Gure ezaugarritutako SPACA6 molekula birkonbinatzaileak eta bere ebatzitako egiturak egitura partekatu horien arteko erlazioak eta gametoen eranskinean eta fusioan duten eginkizunaren berri emango dute.
Aurreikusitako giza SPACA6 ektodomeinuari dagokion DNA sekuentzia (NCBI sarbide-zenbakia NP_001303901.1; 27-246 hondakinak) kodoi bidez optimizatu zen Drosophila melanogaster S2 zeluletan adierazteko eta gene-zati gisa sintetizatu zen Kozak (Eurofins Genomics) kodetzen duen sekuentziarekin., BiP jariatze-seinalea eta dagozkion 5′ eta 3′ muturrak gene honen ligatze-independentea den klonatzeko pMT adierazpen-bektore batean oinarritutako puromizinarekin (pMT-puro) aukeratzeko eraldatutako metalotioneina sustatzaile batean oinarrituta.pMT-puro bektoreak tronbinaren zatiketa gune bat kodetzen du, eta ondoren 10x-His C-terminal etiketa (S2 irudia).
SPACA6 pMT-puro bektorearen transfekzio egonkorra D. melanogaster S2 (Gibco) zeluletara IZUMO1 eta JUNO43rako erabilitako protokoloaren antzera egin zen.S2 zelulak desizoztu eta Schneider-en medioan (Gibco) hazi ziren, % 10eko (v/v) bero-inaktibatuta dagoen fetuaren serum (Gibco) eta 1X antimikotiko antibiotikoarekin (Gibco) azken kontzentrazioarekin.Lehen pasabideko zelulak (3,0 x 106 zelulak) 6 hobietako plaken (Corning) hobi indibidualetan xaflatu ziren.24 ordu 27 °C-tan inkubatzeko, zelulak SPACA6 pMT-puro bektorearen eta Effectene transfekzio erreaktiboaren (Qiagen) 2 mg-ren nahasketa batekin transfektatu ziren fabrikatzailearen protokoloaren arabera.Transfektatutako zelulak 72 orduz inkubatu eta gero 6 mg/ml puromizinarekin bildu ziren.Ondoren, zelulak Schneider-en euskarri osotik isolatu ziren eta serumik gabeko Insect-XPRESS euskarri batean (Lonza) jarri zituzten eskala handiko proteinak ekoizteko.S2 zelula-kulturako 1 L-ko lote bat 8-10 × 106 ml-1 zeluletara hazi zen 2 L-ko polipropilenozko Erlenmeyer matraze aireztatutako hondo lau batean eta gero esterilizatu zen 500 µM CuSO4 (Millipore Sigma) azken kontzentrazioarekin eta esterilizatu egin zen.induzitua.Induzitutako kulturak 27° C-tan inkubatu ziren 120 bira/min-tan lau egunez.
SPACA6 duen medio girotua zentrifugazio bidez isolatu zen 5660 × g-tan 4 ° C-tan, eta, ondoren, Centramate fluxu tangentziala iragazteko sistema (Pall Corp) 10 kDa MWCO mintz batekin isolatu zen.Aplikatu SPACA6 duen medio kontzentratua 2 ml Ni-NTA agarosa erretxina (Qiagen) zutabe batean.Ni-NTA erretxina A tamponaren 10 zutabe-bolumenekin (CV) garbitu zen eta gero A tamponaren CV 1 gehitu zen 50 mM-ko azken imidazol kontzentrazioa emateko.SPACA6 imidazolarekin osatutako 10 ml tamponarekin eluatu zen 500 mM-ko azken kontzentrazioraino.Murrizketa klaseko tronbina (Millipore Sigma) zuzenean gehitu zitzaion dialisi-hodiari (MWCO 12-14 kDa) 1 unitate bakoitzeko SPACA6 mg vs. 1 L 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 eta 150 mM NaCl (buffer B) dialisirako.) 4°C-tan 48 orduz.Ondoren, tronbinaz moztutako SPACA6 hiru aldiz diluitu zen gatz-kontzentrazioa murrizteko eta 1 ml MonoS 5/50 GL katioi-truke zutabe batean kargatu zen (Cytiva/GE) 10 mM Tris-HClrekin orekatuta, pH 7,5.Katioi-trukagailua 3 OK 10 mM Tris-HCl-rekin garbitu zen, pH 7,5, eta gero SPACA6 0 eta 500 mm-ko NaCl-ko gradiente lineal batekin eluatu zen 10 mm-ko Tris-HCl-n, pH 7,5 25 OK-tan.Ioi-trukearen kromatografiaren ondoren, SPACA6 1 ml-ra kontzentratu zen eta isokratikoki eluatu zen ENrich SEC650 10 x 300 zutabe batetik (BioRad) B tamponarekin orekatuta. Kromatogramaren arabera, SPACA6 duten igeriketa eta kontzentratuaren frakzioak.Garbitasuna Coomassie-k tindatutako elektroforesiaren bidez kontrolatu zen %16ko SDS-poliakrilamida gel batean.Proteinen kontzentrazioa 280 nm-ko absorbantziaz kuantifikatu zen Beer-Lambert legea eta desagertze koefiziente molar teorikoa erabiliz.
SPACA6 araztua gau osoan dializatu zen 10 mM sodio fosfatoaren, pH 7,4 eta 150 mM NaFren aurka eta 0,16 mg/mL-ra diluitu zen CD espektroskopia bidez aztertu aurretik.185 eta 260 nm-ko uhin-luzera duten CDen eskaneaketa espektrala Jasco J-1500 espektropolarimetro batean bildu zen 1 mm-ko bide optikoa (Helma) duten kuartzozko kubetak erabiliz 25 °C-tan 50 nm/min-ko abiaduran.CD espektroak oinarrizko lerroan zuzendu ziren, 10 eskuraketetan batez bestekoa egin zuten eta batez besteko hondar-eliptikotasunera (θMRE) bihurtu ziren cm2/dmol gradutan:
non MW lagin bakoitzaren pisu molekularra den Da-n;N aminoazido kopurua da;θ eliptikotasuna miligradutan da;d bide optikoaren luzerari dagokio cm-tan;proteina-kontzentrazioa unitateetan.